Leica HMB45, PA0027 User Manual

Bond™ Ready-to-Use Primary Antibody
Melanoma Marker (HMB45)

Catalog No: PA0027

Leica Biosystems Newcastle Ltd
Balliol Business Park West
Benton Lane
Newcastle Upon Tyne NE12 8EW
United Kingdom
( [phone]

Instructions for Use

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Mode d’Emploi

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Istruzioni per l’uso

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Gebrauchsanweisung

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Instrucciones de Uso

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Instruções de Utilização

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www.LeicaBiosystems.com

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Bond™ Ready-To-Use Primary Antibody
Melanoma Marker (HMB45)

Catalog No: PA0027

Intended Use

This reagent is for in vitro diagnostic use.

Melanoma Marker (HMB45) monoclonal antibody is intended to be used for the qualitative identication by light microscopy of human
HMB45 antigen in formalin-xed, parafn-embedded tissue by immunohistochemical staining using an automated Bond system.

The clinical interpretation of any staining or its absence should be complemented by morphological studies and proper controls and
should be evaluated within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualied pathologist.

Summary and Explanation

Immunohistochemical techniques can be used to demonstrate the presence of antigens in tissue and cells (see “Using Bond Reagents”
in your Bond user documentation). Melanoma Marker (HMB45) primary antibody is a ready-to-use product that is recommended for use
with either the Bond Polymer Rene Detection or Bond Polymer Rene Red Detection. The demonstration of human HMB45 antigen is
achieved by rst allowing the binding of Melanoma Marker (HMB45) to the section, and then visualizing this binding using the reagents
provided in the detection system. The use of these products, in combination with an automated Bond system, reduces the possibility of
human error and inherent variability resulting from individual reagent dilution, manual pipetting and reagent application.

Reagents Provided

Melanoma Marker (HMB45) is a mouse anti-human monoclonal antibody produced as a tissue culture supernatant, and supplied in Tris
buffered saline with carrier protein, containing 0.35% ProClin™ 950 as a preservative.

Total volume = 7 mL.

Clone

HMB45.

Immunogen

Extract of pigmented melanoma metastases from lymph nodes.

Specicity

Human HMB45 antigen.

Subclass

IgG1, Kappa.

Total Protein Concentration

Approx 10 mg/mL.

Antibody Concentration

Greater than or equal to 1.3 mg/L as determined by ELISA.

Dilution and Mixing

Melanoma Marker (HMB45) primary antibody is optimally diluted for use on the automated Bond system. Reconstitution, mixing, dilution
or titration of this reagent is not required.

Materials Required But Not Provided

Refer to “Using Bond Reagents” in your Bond user documentation for a complete list of materials required for specimen treatment and
immunohistochemical staining using the automated Bond system.

Storage and Stability

Store at 2–8 °C. Do not use after the expiration date indicated on the container label.
The signs indicating contamination and/or instability of Melanoma Marker (HMB45) are: turbidity of the solution, odor development, and

presence of precipitate.
Return to 2–8 °C immediately after use.
Storage conditions other than those specied above must be veried by the user1.

Precautions

• This product is intended for in vitro diagnostic use.

• The concentration of ProClin™ 950 is 0.35%. It contains the active ingredient 2-methyl-4-isothiazolin-3-one, and may cause irritation
to the skin, eyes, mucous membranes and upper respiratory tract. Wear disposable gloves when handling reagents.

• To obtain a copy of the Material Safety Data Sheet contact your local distributor or regional ofce of Leica Biosystems, or alternatively,
visit the Leica Biosystems Web site, www.LeicaBiosystems.com

• Specimens, before and after xation, and all materials exposed to them, should be handled as if capable of transmitting infection and
disposed of with proper precautions2. Never pipette reagents by mouth and avoid contacting the skin and mucous membranes with
reagents or specimens. If reagents or specimens come in contact with sensitive areas, wash with copious amounts of water. Seek
medical advice.

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• Consult Federal, State or local regulations for disposal of any potentially toxic components.

• Minimize microbial contamination of reagents or an increase in non-specic staining may occur.

• Retrieval, incubation times or temperatures other than those specied may give erroneous results. Any such change must be
validated by the user.

Instructions for Use

Melanoma Marker (HMB45) primary antibody is recommended for use on an automated Bond system in combination with either
Bond Polymer Rene Detection (DS9800) or Bond Polymer Rene Red Detection (DS9390). The recommended staining protocols for
Melanoma Marker (HMB45) primary antibody are IHC Protocol F when using Bond Polymer Rene Detection and IHC Protocol J when
using Bond Polymer Rene Red Detection. Enzyme pretreatment is recommended using Bond Enzyme 1 for 5 minutes.

Results Expected

Normal Tissues
Melanoma Marker (HMB45) showed positive granular, cytoplasmic staining in melanocytes in the basal layer of epidermis. All other

normal tissues were negative. (Total number of cases stained = 99).

Tumor Tissues

Melanoma Marker (HMB45) stained 13/13 malignant melanomas. No staining was observed in a variety of other tumors. (Total number
of cases stained = 101).

Melanoma Marker (HMB45) is recommended for use as part of a panel of antibodies for the diagnosis of melanomas.

Product Specic Limitations

Melanoma Marker (HMB45) is recommended for use with either Bond Polymer Rene Detection or Bond Polymer Rene Red Detection
and Bond ancillary reagents. Users who deviate from recommended test procedures must accept responsibility for interpretation
of patient results under these circumstances. The protocol times may vary, due to variation in tissue xation and the effectiveness
of antigen enhancement, and must be determined empirically. Negative reagent controls should be used when optimizing retrieval
conditions and protocol times.

Troubleshooting

Refer to reference 3 for remedial action.
Contact your local distributor or the regional ofce of Leica Biosystems to report unusual staining.

Further Information

Further information on immunostaining with Bond reagents, under the headings Principle of the Procedure, Materials Required,
Specimen Preparation, Quality Control, Assay Verication, Interpretation of Staining, Key to Symbols on Labels, and General Limitations
can be found in “Using Bond Reagents” in your Bond user documentation.

Bibliography

1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988, Final Rule 57 FR 7163 February 28, 1992.

2. Villanova PA. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of laboratory workers from infectious
diseases transmitted by blood and tissue; proposed guideline. 1991; 7(9). Order code M29-P.

3. Bancroft JD and Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques. 4th Edition. Churchill Livingstone, New York. 1996.

4. Kapur RP, Bigler SA, Skelly M, et al. Anti-melanoma monoclonal antibody HMB45 identies an oncofetal glycoconjugate associated
with immature Melanoma Markers. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1992; 40(2):207-212.

5. Gown AM, Vogel AM, Hoak D, et al. Monoclonal antibodies specic for melanocytic tumours distinguish subpopulations of
melanocytes. American Journal of Pathology. 1986;123(2):195-203.

ProClin™ 950 is a trademark of Supelco, a part of Sigma-Aldrich Corporation.

Date of Issue

09 May 2013

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Anticorps Primaire Prêt À L’Emploi Bond™
Melanoma Marker (HMB45)

Référence: PA0027

Utilisation Prévue

Ce réactif est destiné au diagnostic in vitro.

L’anticorps monoclonal Melanoma Marker (HMB45) est destiné à l’identication qualitative par microscopie optique de l’antigène
humain HMB45 dans des tissus xés au formol et enrobés de parafne par coloration immunohistochimique à partir d’un système Bond
automatisé.

L’interprétation clinique de tout marquage ou de son absence doit être complétée par des études morphologiques utilisant des contrôles
appropriés et évaluée dans le contexte des antécédents cliniques du patient et des autres tests diagnostiques par un pathologiste
qualié.

Résumé et Explications

Les techniques immunohistochimiques peuvent être utilisées pour la mise en évidence d’antigènes sur tissus ou cellules (voir “Utilisation
des réactifs Bond” dans votre manuel d’utilisation Bond). L’anticorps primaire Melanoma Marker (HMB45) est un produit prêt à l’emploi
recommandé pour être utilisé soit avec le Bond Polymer Rene Detection ou le Bond Polymer Rene Red Detection. La démonstration
de l’antigène humain HMB45 s’effectue d’abord par la liaison du Melanoma Marker (HMB45) à la coupe, et par la visualisation de cette
liaison via les réactifs fournis dans le système de détection. L’utilisation de ces produits, en association avec l’automate Bond, réduit
l’éventualité d’une erreur humaine et la variabilité intrinsèque résultant de la dilution, du pipetage manuel et de l’application à titre
individuel des réactifs.

Réactifs Fournis

Melanoma Marker (HMB45) est un anticorps monoclonal anti-humain de souris, produit par surnageant de culture de tissu et conditionné
dans du tampon salin Tris contenant une protéine de transport et 0,35 % de ProClin™ 950 (conservateur).

Volume total = 7 ml.

Clone

HMB45.

Immunogène

Extrait de métastases de mélanomes pigmentés des noeuds lymphoïdes.

Spécicité

Antigène humain HMB45.

Sous-classe

IgG1, Kappa.

Concentration Totale en Protéine

Environ 10 mg/ml.

Concentration en Anticorps

Supérieure ou égale à 1,3 mg/l, déterminée par ELISA.

Dilution et Mélange

L’anticorps primaire Melanoma Marker (HMB45) est à dilution optimale pour utilisation dans l’automate Bond. Reconstitution, mélange,
dilution ou titration de ce réactif non nécessaire.

Matériel Nécessaire Mais Non Fourni

Voir “Utilisation des réactifs Bond” dans votre manuel d’utilisation Bond pour obtenir la liste complète du matériel nécessaire au
traitement des échantillons et au marquage immunohistochimique avec le système Bond.

Conservation et Stabilité

Conserver à une température comprise entre 2–8 °C. Ne pas utiliser après la date de péremption indiquée sur l’étiquette du récipient.
Les signes indicateurs d’une contamination et/ou d’une instabilité de Melanoma Marker (HMB45) sont les suivants : une turbidité de la

solution, la formation d’odeurs et la présence d’un précipité.
Remettre à 2–8 °C immédiatement après usage.
Des conditions de stockage différentes de celles ci-dessus doivent être contrôlées par l’utilisateur1.

Précautions

• Ce produit est conçu pour le diagnostic in vitro.

• La concentration en ProClin™ 950 est de 0,35%. Contient du 2-méthyl-4-isothiazoline-3-one (ingrédient actif) et peut entraîner des
irritations de la peau, des yeux, des muqueuses et des voies aériennes supérieures. Porter des gants jetables lors de la manipulation
des réactifs.

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• Pour obtenir un exemplaire de la che technique des substances dangereuses (Material Safety Data Sheet), contactez votre
distributeur local ou le bureau régional de Leica Biosystems, ou consultez le site Web de Leica Biosystems :
www.LeicaBiosystems.com

• Les échantillons, avant et après xation, et tous les matériels ayant été en contact avec eux, doivent être manipulés comme s’ils
étaient à risque infectieux et éliminés avec les précautions adéquates2. Ne jamais pipeter les réactifs à la bouche et éviter le contact
de la peau et des muqueuses avec les réactifs ou les échantillons. Si des réactifs ou des échantillons entrent en contact avec des
zones sensibles, rincer abondamment à l’eau. Consultez un médecin.

• Renseignez-vous sur les règlements fédéraux, nationaux et locaux pour l’élimination des composés potentiellement toxiques.

• Éviter une contamination microbienne des réactifs, qui peut favoriser un marquage non spécique.

• Des durées ou des températures de démasquage ou d’incubation autres que celles spéciées peuvent entraîner des résultats
erronés. Tout changement doit être validé par l’utilisateur.

Mode d’Emploi

L’anticorps primaire Melanoma Marker (HMB45) est recommandé pour être utilisé sur un système Bond automatisé en combinaison
avec le Bond Polymer Rene Detection (DS9800) ou le Bond Polymer Rene Red Detection (DS9390). Les protocoles de coloration
recommandés pour l’anticorps primaire Melanoma Marker (HMB45) sont l’IHC Protocol F pour l’utilisation du Bond Polymer Rene
Detection et l’IHC Protocol J pour l’utilisation du Bond Polymer Rene Red Detection. Un prétraitement enzymatique est recommandé en
utilisant Bond Enzyme 1 pendant 5 minutes.

Résultats Attendus

Tissus Sains
Le Melanoma Marker (HMB45) a présenté une coloration cytoplasmique granulaire positive dans les mélanocytes de la couche basale

de l’épiderme. Tous les autres tissus normaux étaient négatifs. (Nombre total de cas colorés = 99).
Tissus Tumoraux
Le Melanoma Marker (HMB45) a coloré 13/13 mélanomes malins. Aucune coloration n’a été observée dans les autres tumeurs.

(Nombre total de cas colorés = 101).

Melanoma Marker (HMB45) est recommandé pour être utilisé en tant que composant d’un panel d’anticorps pour le diagnostic
de mélanomes.

Limites Spéciques du Produit

Melanoma Marker (HMB45) est recommandé pour être utilisé soit avec le Bond Polymer Rene Detection ou le Bond Polymer Rene
Red Detection et les réactifs auxiliaires Bond. Les utilisateurs qui s’écartent des procédures recommandées prennent la responsabilité
de l’interprétation des résultats des patients dans ces conditions. Les durées du protocole peuvent varier, en raison des variations de
xation des tissus et de l’efcacité de la facilitation de l’antigène, et doivent être déterminées empiriquement. Des contrôles réactif
négatifs doivent être testés lors de l’optimisation des conditions de démasquage et des durées du protocole.

Identication des Problèmes

Voir la référence 3 pour connaître les mesures correctives.
Prenez contact avec votre distributeur local ou avec le bureau régional de Leica Biosystems pour signaler tout marquage inattendu.

Informations Complémentaires

Des informations complémentaires sur l’immunomarquage avec les réactifs Bond, les principes de la méthode, le matériel nécessaire, la
préparation des échantillons, le contrôle qualité, les vérications d’analyse, l’interprétation du marquage, les légendes et symboles sur
les étiquettes et les limites générales, peuvent être obtenues dans “Utilisation des réactifs Bond” dans votre manuel d’utilisation Bond.

Bibliographie

1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988, Final Rule 57 FR 7163 February 28, 1992.

2. Villanova PA. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of laboratory workers from infectious
diseases transmitted by blood and tissue; proposed guideline. 1991; 7(9). Order code M29-P.

3. Bancroft JD and Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques. 4th Edition. Churchill Livingstone, New York. 1996.

4. Kapur RP, Bigler SA, Skelly M, et al. Anti-melanoma monoclonal antibody HMB45 identies an oncofetal glycoconjugate associated
with immature Melanoma Markers. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1992; 40(2):207-212.

5. Gown AM, Vogel AM, Hoak D, et al. Monoclonal antibodies specic for melanocytic tumours distinguish subpopulations of
melanocytes. American Journal of Pathology. 1986;123(2):195-203.

ProClin™ 950 est une marque commerciale de Supelco, membre du groupe Sigma-Aldrich Corporation.

Date de Publication

09 mai 2013

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Anticorpo Primario Pronto All’Uso Bond™
Melanoma Marker (HMB45)

N. catalogo: PA0027

Uso previsto

Reagente per uso diagnostico in vitro.

L’anticorpo monoclonale Melanoma Marker (HMB45) deve essere utilizzato per l’identicazione qualitativa tramite microscopio ottico
dell’antigene umano HMB45 in tessuto ssato in formalina, incluso in parafna tramite colorazione immunoistochimica con un sistema
Bond automatizzato.

L’interpretazione clinica di un’eventuale colorazione, o della sua assenza, deve avvalersi di studi morfologici e di opportuni controlli ed
essere effettuata da patologi qualicati, nel contesto dell’anamnesi clinica del paziente e di altri test diagnostici.

Sommario e spiegazione

Grazie alle tecniche di immunoistochimica è possibile dimostrare la presenza di antigeni nel tessuto e nelle cellule (vedere “Uso dei
reagenti Bond” nella documentazione per l’utente Bond). L’anticorpo primario Melanoma Marker (HMB45) è un prodotto pronto per
l’uso che si raccomanda di utilizzare con Bond Polymer Rene Detection o Bond Polymer Rene Red Detection. La dimostrazione
dell’antigene umano HMB45 si ottiene in primo luogo consentendo il legame del Melanoma Marker (HMB45) con la sezione, e quindi
visualizzando il legame stesso per mezzo dei reagenti forniti nel sistema di rilevazione. L’impiego di questi prodotti, insieme al sistema
automatizzato Bond, riduce la possibilità di un errore umano e la relativa variabilità che deriva dalla diluizione individuale del reagente e
dal pipettamento e dall’applicazione del reagente eseguiti manualmente.

Reagenti forniti

Il Melanoma Marker (HMB45) è un anticorpo monoclonale murino anti-umano prodotto come surnatante di coltura tissutale e fornito in
soluzione salina tamponata Tris con proteina carrier, contenente 0,35% di ProClin™ 950 come conservante.

Volume totale = 7 ml.

Clone

HMB45.

Immunogeno

Estratto di metastasi di melanoma pigmentato da linfonodi.

Specicità

Antigene umano HMB45.

Sottoclasse

IgG1, Kappa.

Concentrazione proteica totale

Circa 10 mg/ml.

Concentrazione dell’Anticorpo

Uguale o superiore a 1,3 mg/l, determinata mediante ELISA.

Diluizione e miscelazione

La diluizione dell’anticorpo primario Melanoma Marker (HMB45) è stata ottimizzata per l’uso con il sistema Bond. Non è necessario
ricostituire, miscelare, diluire o titolare il reagente.

Materiale necessario non fornito

Per un elenco completo del materiale necessario per il trattamento del campione e la colorazione immunoistochimica con il sistema
Bond, consultare l’”Uso dei reagenti Bond” nella documentazione per l’utente Bond.

Conservazione e stabilità

Conservare a 2–8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza indicata sull’etichetta del contenitore.
I segni di contaminazione e/o instabilità del Melanoma Marker (HMB45) sono: torbidità della soluzione, formazione di odori e presenza

di un precipitato.
Dopo l’uso riportare immediatamente a 2–8 °C.
L’utente deve vericare eventuali condizioni di conservazione diverse da quelle specicate1.

Precauzioni

• Il prodotto è destinato all’uso diagnostico in vitro.

• La concentrazione del ProClin™ 950 è 0,35%. Esso contiene il principio attivo 2-metil-4-isotiazolin-3-one e può causare irritazione alla
cute, agli occhi, alle mucose e alle alte vie respiratorie. Per la manipolazione dei reagenti usare guanti monouso.

• Una copia della Scheda di sicurezza può essere richiesta al distributore locale o all’ufcio di zona di Leica Biosystems o, in
alternativa, visitando il sito di Leica Biosystems www.LeicaBiosystems.com

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• I campioni, prima e dopo la ssazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere manipolati come potenziali vettori di infezione
e smaltiti con le opportune precauzioni2. Non pipettare mai i reagenti con la bocca ed evitare il contatto dei reagenti e dei campioni
con la cute e le mucose. Se un reagente o un campione viene a contatto con zone sensibili, lavare abbondantemente con acqua.
Consultare un medico.

• Consultare la normativa nazionale, regionale o locale per lo smaltimento dei componenti potenzialmente tossici.

• Ridurre al minimo la contaminazione microbica dei reagenti per non incrementare il rischio di una colorazione non specica.

• Tempi o temperature di incubazione o di riconoscimento diversi da quelli specicati possono fornire risultati erronei. Ogni eventuale
modica deve essere convalidata dall’utente.

Istruzioni per l’uso

Si raccomanda di utilizzare l’anticorpo primario Melanoma Marker (HMB45) su un sistema Bond automatizzato in associazione con
Bond Polymer Rene Detection (DS9800) o Bond Polymer Rene Red Detection (DS9390). I protocolli di colorazione raccomandati per
l’anticorpo primario Melanoma Marker (HMB45) sono IHC Protocol F se si utilizza Bond Polymer Rene Detection e IHC Protocol J se si
utilizza Bond Polymer Rene Red Detection. Si consiglia il pretrattamento enzimatico con il Bond Enzyme 1 per 5 minuti.

Risultati attesi

Tessuti normali

Il Melanoma Marker (HMB45) ha mostrato colorazione citoplasmatica, granulare positiva in melanociti nello strato basale
dell’epidermide. Tutti i tessuti normali erano negativi. (Numero totale di casi colorati = 99).

Tessuti tumorali

Il Melanoma Marker (HMB45) ha colorato melanomi maligni (13/13). Non si è osservata nessuna colorazione in una serie di altri tumori.
(Numero totale di casi colorati = 101).

Si raccomanda di utilizzare il Melanoma Marker (HMB45) come parte di un pannello di anticorpi per la diagnosi di melanomi.

Limitazioni speciche del prodotto

Si raccomanda di utilizzare il Melanoma Marker (HMB45) con Bond Polymer Rene Detection o Bond Polymer Rene Red Detection e
reagenti sussidiari Bond. Gli utenti che modicano le procedure raccomandate devono assumersi la responsabilità dell’interpretazione
dei risultati relativi ai pazienti in tali circostanze. I tempi del protocollo possono variare in base alle variazioni nella ssazione del tessuto
e nell’efcienza del potenziamento dell’antigene e devono essere deniti in modo empirico. Nell’ottimizzazione delle condizioni di
riconoscimento e dei tempi del protocollo si devono impiegare dei controlli negativi del reagente.

Soluzione problemi

Per i provvedimenti consultare il riferimento bibliograco n. 3.
Per riferire una colorazione inusuale rivolgersi al distributore locale o all’ufcio di zona di Leica Biosystems.

Ulteriori informazioni

Ulteriori informazioni sull’immunocolorazione con i reagenti Bond si trovano in “Uso dei reagenti Bond” nella documentazione per
l’utente Bond, ai titoli Principio della procedura, Materiali necessari, Preparazione del campione, Controllo di qualità, Verica del saggio,
Interpretazione della colorazione, Leggenda dei simboli e delle etichette e Limitazioni generali.

Bibliograa

1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988, Final Rule 57 FR 7163 February 28, 1992.

2. Villanova PA. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of laboratory workers from infectious
diseases transmitted by blood and tissue; proposed guideline. 1991; 7(9). Order code M29-P.

3. Bancroft JD and Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques. 4th Edition. Churchill Livingstone, New York. 1996.

4. Kapur RP, Bigler SA, Skelly M, et al. Anti-melanoma monoclonal antibody HMB45 identies an oncofetal glycoconjugate associated
with immature Melanoma Markers. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1992; 40(2):207-212.

5. Gown AM, Vogel AM, Hoak D, et al. Monoclonal antibodies specic for melanocytic tumours distinguish subpopulations of
melanocytes. American Journal of Pathology. 1986;123(2):195-203.

ProClin™ 950 è un marchio di fabbrica di Supelco, società del gruppo Sigma-Aldrich.

Data di pubblicazione

09 maggio 2013

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