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Leica DVM - 3D Visualisierung

Vertikale Auflösung im Spannungsfeld von Numerischer Apertur und
Schärfentiefe

Living up to Life

Vertikale Auflösung im Spannungsfeld von

Numerischer Apertur und Schärfentiefe

Für eine Vielzahl von industriellen Qualitätsprüfungen bietet die Digitalmikroskopie eindeutige Vorteile, insbeson­dere für Oberflächenanalysen. Bruchanalysen, Analysen von geneigten oder vertikalen Oberflächen oder Vor-Ort­Inspektionen von großen Bauteilen wie Turbinenrotoren sind nur Beispiele dafür, wo Digitalmikroskope ihre Stärken
voll ausspielen. Aber was sind nun die Schlüsselkriterien für einen erfolgreichen Einsatz von Digitalmikroskopen, und
welche Parameter beeinflussen die zu erwartende dreidimensionale Bildgebung bei diesen Proben.

Einer der Hauptmerkmale eines digitalen Mikroskops ist die schnelle und problemlose Erstellung von Oberflächenmodellen
von makro- und mikroskopischen Strukturen. Diese führen einerseits bei einer qualitativen Bewertung zu einem besse­ren Verständnis und Dokumentation der Probe und andererseits kann durch die Quantifizierung der Oberfläche wertvolle
Information zur Oberflächenbeschaffenheit oder deren Verschleiss gewonnen werden. Welche Proben eigenen sich für
den Einsatz mit einem Leica Digitalmikroskop und was sind die Limitationen von der eingesetzten Methode?

Die dreidimensionale Bildgebung der Leica DVM Serie beruht auf dem Prinzip der Fokus Variation. Die begrenzte
Tiefenschärfe der Optik wird ausgenutzt um die Tiefeninformation der Probe zu ermitteln. Durch vertikales Verfahren der
Probe relativ zum Objektiv wird die Schärfeinformation zusammen mit dem Abstand zur Optik ermittelt. Bei jeder ver­tikalen Position wird jeweils der scharfe vom unscharfen Bereich des Bildes getrennt und von der Software zu einem
Oberflächenmodell verarbeitet. Einer der Vorteile von diesem Verfahren ist, dass zusätzlich zur Höheninformation eben­falls noch die Textur der Probe dokumentiert wird.

Welche Einflussgrössen sind ausschlaggebend für eine erfolgreiche Modellierung eines 3 D Oberflächenmodells und
wie beeinflussen diese Grössen die laterale und vertikale Auflösung?

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Optik und Oberflächen

Schärfentiefe

Die älteste Publikation zur visuell
empfundenen Schärfentiefe stammt
von Max Berek. Bereits 1927 hat er
die Resultate seiner umfangreichen
Versuche veröffentlicht. Für die visu­elle Schärfentiefe liefert die Bereksche
Formel praxistaugliche Werte und wird
deshalb auch heute noch angewendet.
In vereinfachter Form lautet sie:

T

= n·[l/(2·NA2) + 340 μm/(NA·M

VIS

T

: visuell empfundene Schärfentiefe

VIS

n: Brechungsindex des Mediums, in
dem sich das Objekt befindet. Wird das
Objekt bewegt, ist der Brechungsindex
des Mediums einzusetzen, das den
sich verändernden Arbeitsabstand
bildet.

1. Optik – Im Spannungsfeld von Numerischer Apertur und Schärfentiefe

Schärfentiefe ist in der Mikroskopie eine oft empirisch verstandene
Messgröße. In der Praxis bestimmen die Zusammenhänge zwischen
numerischer Apertur, Auflösung und Vergrößerung diesen Parameter.
Moderne Mikroskope erzeugen mit ihren Einstellmöglichkeiten eine
für den visuellen Eindruck optimale Balance zwischen Schärfentiefe
und Auflösung – zwei Parameter, die sich prinzipiell gegenläufig ver­halten. In DIN/ISO-Normen wird die objektseitige Schärfentiefe defi­niert als „Axiale Tiefe des Raums beidseitig der Objektebene, in dem das
Objekt ohne nachweisbaren Schärfeverlust bewegt werden kann, wäh­rend die Positionen von Bildebene und Objektiv unverändert bleiben“.

Wie die Nachweisgrenze des Schärfeverlustes ermittelt werden sollte,
liefert die Norm allerdings keinen Hinweis. Insbesondere bei niedrigen
Vergrößerungen lässt sich die Schärfentiefe durch Abblenden, das heißt
durch Verkleinern der numerischen Apertur, stark erhöhen. Dies erfolgt
üblicherweise mit der Aperturblende bzw. einer Blende, die auf einer konju­gierten Ebene zu dieser liegt. Mit geringer werdender numerischer Apertur
nimmt aber auch die laterale Auflösung ab. Es gilt je nach Objektstruktur
die optimale Balance zwischen Auflösung und Schärfentiefe zu finden.

TOT VIS

)]

l: Wellenlänge des benutzten Lichts,

bei Weißlicht ist lambda = 0.55 μm
NA: objektseitige numerische Apertur
M

des Mikroskops
Ersetzt man in der obigen Gleichung

die visuelle Gesamtvergrößerung
durch die Beziehung der förderli­chen Vergrößerung (M
1000·NA), wird deutlich, dass sich
die Schärfentiefe in erster Näherung
umgekehrt proportional zur numeri­schen Apertur im Quadrat verhält.

: visuelle Gesamt-vergrößerung

TOT VIS

TOT VIS

4

= 500 bis

2. Textur der Probe

Die Textur, auch Beschaffenheit der Probenoberfläche genannt, umfasst die
Gesamtheit der Merkmale und Merkmalswerte der Probe. Es handelt sich
hierbei um Farbliche- und Helligkeitsmerkmale der Oberfläche. Das Prinzip
der Fokus Variation beruht wie eingangs beschrieben auf dem methodi­schen Ansatz der Probenunschärfe. Je besser die Probe in scharfe und
unscharfe Bereich unterteilt werden kann, desto besser werden auch die
Resultate des Oberflächenmodells. Vor allem Texturen, welche über einen
guten Kontrast verfügen, eignen sich hervorragend für diese Methode. Die
Beleuchtung erhält, wie in vielen Anwendungsbereichen der Mikroskopie,
einen Sonderstatuts, da sie sehr oft über Erfolg oder Misserfolg entschei­det. Durch Auswahl einer geeigneten Beleuchtung kann auch eine Probe
mit geringer Textur, zum Beispiel mit einer Auflicht-Schrägbeleuchtung,
welche auch versteckte Strukturen zum Vorschein bringt, mit diesem
Verfahren durch ein Oberflächenmodell dokumentiert werden

Mechanik und Beleuchtung

3. Mechanische Auflösung in vertikaler Richtung

Der dritte Einflussfaktor in dieser Gleichung ist die mecha­nische Auflösung in vertikaler Richtung. Unter diesem
Begriff versteht man die kleinsten möglichen Schritte in
z-Richtung, des in der Regel motorisierten Fokussiertriebs.
Um die Leistungsfähigkeit der Optik auszunutzen muss der
kleinste mögliche Schritt jeweils kleiner wie die aktuell
genutzte Schärfentiefe sein, da sonst Bildinformationen
verloren gehen. Ein motorisierter Fokustrieb mit beispiels­weise 10 μm Auflösung ist geeignet bei einer Schärfentiefe
von 15 μm.

Welche lateralen und vertikalen Auflösungen sind
nun mit einem Leica DVM System möglich? Wie oben
beschrieben hängen diese Parameter von verschiedenen
Einflussgrössen, wie Oberflächenstruktur oder Beleuchtung
ab und sind demzufolge abhängig von der Anwendung zu
ermitteln. Durch Interpolation wird eine vertikale Auflösung
von der Hälfte der angewendeten Schärfentiefe erreicht.
Die laterale Auflösung wird bestimmt durch die Numerische
Apertur der verwendeten Vergrösserung.

Beleuchtung

Die Auswahl der geeigneten Beleuchtung
entscheidet über Erfolg oder Misserfolg
der Untersuchung. Das Leica DVM
Produktkonzept erlaubt durch den modularen
Aufbau die gewählte Optik jeweils mit einer
für die Anwendung optimale Beleuchtung zu
kombinieren. Zur Auswahl stehen folgende
Verfahren:

1) Variables schräges Auflicht: Diese Methode
ändert die Beleuchtungsrichtung von verti­kal zu lateral. Dieser Ansatz eignet sich zur
Visualisierung von Kratzern oder kleinen
Vertiefungen.

2) Diffusor: Bei glänzenden Oberflächen ist
oftmals der Dynamikbereich der Kamera unzu­reichend und es sind viele Bereiche der Probe
überstrahlt. Ein Diffusor liefert eine zuverläs­sige Reduktion des überstrahlten Bereichs.

3) Koaxiale Beleuchtung: Eine koaxiale
Beleuchtung wird bei stark glänzenden oder
spiegelnden Oberflächen, wie z.B. Wafer oder
Metallschliffe, eingesetzt.

4) Polarisiertes Licht: wird verwendet
zur Unterdrückung von Reflexen oder
Dokumentation von Kunststoffen.

5) Koaxiale Beleuchtung mit gerichtetem
Licht: Bei oben genannten Anwendungen wird
durch das gerichtete Licht ein dreidimensio­naler Eindruck der Probe erzeugt. Dies ist oft­mals Hilfreich zur genaueren Bestimmung der
Oberfläche.

6

u

Münze in Auflicht Münze in schrägem Auflicht

v

Löststelle ohne Diffusor Lötstelle mit Diffusor

w

Halbleiterstrukturen mit Koaxialbeleuchtung Halbleiterstrukturen mit Koaxialbeleuchtung

x

Kunststoff mit polarisiertem Licht Uhrwerk mit polarisiertem Licht

y

Halbleiterstrukturen mit Koaxialbeleuchtung Halbleiterstrukturen mit gerichteter Koaxialbeleuchtung

Maximale vertikale Auflösungen von Leica DVM Systemen

Zoom Schärfentiefe bei Vmax Vertikale Auflösung

Leica VZ75 C @160x 250 μm 125 μm
Leica VZ80 C / Leica VZ80 RC @ 400x 80 μm 40 μm
Leica VZ100 @ 350x (10450392) 420 μm 210 μm
Leica VZ100 @ 700x (10450393) 110 μm 55 μm
Leica VZ100 @ 1400x (10450394) 4 μm 2 μm
Leica VZ100 @ 1400x (10450395) 3 μm 1.5 μm
Leica VZ100 @ 3500x (10450411) 1 μm 500 nm
Leica VZ100 @ 7000x (10450412) 700 nm 350 nm

Praxisbeispiele

Ein Beispiel aus der Praxis soll diesen Sachverhalt erläu­tern. Die Bruchfläche aus Stahl eines Zugversuchs soll
zur Qualitätsprüfung bestimmt werden. Gewünscht sind
eine qualitative Darstellung und ebenfalls eine quantitative
Aussage über die Oberfläche. Die gewünschte vertikale
Auflösung soll mindestens 120 μm betragen.

Hier sind die optischen und mechanischen Eckdaten der
verwendeten Ausrüstung:

• Benutzte Optik: Leica VZ80 RC, 8:1 Zoom mit
Vergrösserungsbereich 50 – 400x, bei maximaler
Vergrösserung von 400x

• Schärfentiefe bei maximaler Vergrösserung von
400x ist 80 μm

• Auflösung des motorisierten Fokussiertriebs ist 500 nm

In dem aufgeführten Beispiel wird eine theoretische ver­tikale Auflösung von 40μm (Schärfentiefe / 2) erreicht. Die
Textur des zu untersuchenden Objekts hat einen hohen
Kontrastumfang und lässt sich von der Software einfach in
scharfe und unscharfe Bereiche unterteilen. Die gewählte
Leica DVM Ausrüstung eignet sich deshalb ausgezeichnet
für diesen Anwendungsbereich und die geforderte vertikale
Auflösung kann erreicht werden.

Auflösungs- und Applikationsgrenzen von Leica DVM
Systemen

Die geeignete Zoomoptik kann aufgrund der
Probenanforderung einfach bestimmt werden.
Entscheidungskriterien sind in der Regel Sehfeld, laterale
und vertikale Auflösung. Generell ist der Einsatzbereich der
Leica Digital Mikroskopie im mikro- und makroskopischen
Bereich zu finden. Es soll beispielsweise ein Objektfeld von
0,2 mm mit einer vertikalen Auflösung von 10 μm untersucht
werden. Aus den zur Verfügung gestellten technischen
Daten kann ermittelt werden, dass sich das Leica VZ100 mit
einem 140x Objektiv für diese Anwendung eignet. Eine wei­tere Hilfestellung leistet die auf einem Touch Panel basierte
Kontrolleinheit Leica SmartTouch, welche die jeweils ver­wendete Schärfentiefe am Display anzeigt.

Eine Herausforderung bieten Proben, welche beispiels­weise aus transparentem Kunststoff bestehen und im mik­roskopischen Bereich d.h. mit einer digitalen Vergrösserung
von grösser 1400x aufgenommen werden sollten. Das
Material liefert nur wenig Textur und die Resultate, obwohl
das Leica DVM System optisch und mechanisch geeignet
ist, werden unbefriedigend sein.

Welche Alternativen bestehen? Bei Proben mit geringer
Textur kann auf ein anderes bildgebendes Verfahren wie
Konfokalmikroskopie oder Interferometrie umgestiegen
werden. Leica DCM 3D vereinbart beispielsweise beide
Technologien in einem Gerät und eignet sich ausgezeichnet
für Proben mit wenig Textur.

Die links stehende Tabelle liefert eine Übersicht der
Leistungsfähigkeit und Anwendungsbereiche der Leica
DVM Systeme.

“With the user, for the user”
Leica Microsystems

Leica Microsystems operates globally in four divi sions,
where we rank with the market leaders.

Life Science Division

•

The Leica Microsystems Life Science Division supports the
imaging needs of the scientific community with advanced
innovation and technical expertise for the visualization,
measurement, and analysis of microstructures. Our strong
focus on understanding scientific applications puts Leica
Microsystems’ customers at the leading edge of science.

Industry Division

•

The Leica Microsystems Industry Division’s focus is to
support customers’ pursuit of the highest quality end result.
Leica Microsystems provide the best and most innovative
imaging systems to see, measure, and analyze the micro­structures in routine and research industrial applications,
materials science, quality control, forensic science inves­tigation, and educational applications.

Biosystems Division

•

The Leica Microsystems Biosystems Division brings his­topathology labs and researchers the highest-quality,
most comprehensive product range. From patient to pa­thologist, the range includes the ideal product for each
histology step and high-productivity workflow solutions
for the entire lab. With complete histology systems fea­turing innovative automation and Novocastra™ reagents,
Leica Microsystems creates better patient care through
rapid turnaround, diagnostic confidence, and close cus­tomer collaboration.

Surgical Division

•

The Leica Microsystems Surgical Division’s focus is to
partner with and support surgeons and their care of pa­tients with the highest-quality, most innovative surgi cal
microscope technology today and into the future.

The statement by Ernst Leitz in 1907, “with the user, for the user,” describes the fruitful collaboration
with end users and driving force of innovation at Leica Microsystems. We have developed five
brand values to live up to this tradition: Pioneering, High-end Quality, Team Spirit, Dedication to
Science, and Continuous Improvement. For us, living up to these values means: Living up to Life.

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