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Primer
PREMIER
Version 5.0 for Windows and Power
Macintosh
使用说明书
PREMIER
Biosoft International
3786 Corina way,
Palo Alto, CA 94303-4504
电话 650 856-2703
传真 650 843-1250
电子邮件 [email protected]
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目 录
目录 ...........................................………………...................................2
版权声明.................................…………………………….….................5
简介..............…………………………….............................…...............6
新版更新............……………………………………….........................................................6
基础指南
.............................................................……………………..................6
z GENETANK
序列编辑
...........................................…................7
GeneTank Window 序列编辑窗口 ………………………………………………
查看序列..............................................…………………………………….............................7
打开已有序列 ................................................................……………………………….........7
创建新序列...............................................................…………………………………............7
保存序列
编辑序列
查找.........…………....................................................................................8
查看不同链.....................…………………………...……………..........................................8
语音校读
编辑序列比较结果
.................................................................…………………………………...........8
..................................................................………………………………..............8
........................…………….....…………….................................................8
.........…………………...............................................................9
序列粘贴窗口..............…………….……………………………............................9
参数设置
Rating Parameters
...........................……………...............................................9
评分参数
.......................………………………………….................10
序列比较............................……………………….......................10
Alignment Parameters
序列比较参数设置
...................………………...........................10
序列翻译...........................………………………………………….....................12
Edit Codon Table 窗口...........………………………………………………………...............12
7
PRIMER
z
引物设计
.........................…….............................….....14
Primer Premier 引物设计 窗口........................…….....................................14
Direct Select
在序列比较中应用即点即选功能
性状列表
二级结构
即点即选 框.....................................................................….......... 14
..........………………………….............................…........14
....................................……………........................................15
........................................................................…………..15
Edit Primer 引物编辑 窗口.............…..........……..........................................16
Search Criteria 搜索标准 窗口............……..................................................16
Search Parameter 搜索参数 窗口....……………………................................17
2
Page 3
Automatic Search
Manual Search
自动搜索
手动搜索 及引物设计原理......………………………...............................18
...........…………………....................................................17
Search Results 搜索结果 窗口...........……………........................................20
Multiplex/Nested Primer 复式及巢式PCR反应引物 窗口...………………...21
Database 引物数据库 窗口..............................…….....................................21
Reports 分析报告 ...................................……....................................22
Synthesis Order Form 合成订单 ................…………...............................22
Optical Activity
Degeneracy
比吸光度
多义性
..................................………………....................................22
..........................………………..................................................23
Graphs 图表 ..........................………...................................................23
z Restriction Enzyme Analysis
限制性内切酶分析
.………....24
Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析 窗口.............……..........24
Restriction Sites 酶切位点 窗口..............................…………..................24
Edit Enzyme 限制内切酶编辑 窗口.....…………………...............................24
Filter 特征筛选 窗口....................................…………....................................25
Motif Analysis
z
基序分析
.........……………...........................26
Motif Analysis 基序分析 窗口...............…………….....................................26
Motif Sites 基序位点 窗口.....................……......................................26
Edit Motif 基序编辑 窗口....................……..........................................26
Menu Commands
菜单命令
......………....................................27
GeneTank 主菜单..............................…….........................................27
File....................................................……………...................................................27
Edit ..................................................…………….................................................27
View...................................................………….................................................27
Search ...............................................…………................................................27
Function............................................…................................................27
Translate ...........................................……………...............................................28
Window......................................………........................................................28
Help .........................................………….....................................................28
Primer 主菜单.................................................................................28
3
Page 4
File.....................................................................................................28
Edit .................................………………...........................................28
Function.......................………………….....................................................28
Report.................……………................................................................................28
Graph..............…………..................................................................................28
Window...........……………….....................................................................................29
Help ...........………….......................................................................................29
Enzyme Results Menu 主菜单..........……………….....................................29
File...........................…………...........................................................................29
Function..............……………................................................................................29
Window.........................…………….....................................................................29
Help ............................…………........................................................................29
Motif Menu 主菜单..................................................................................29
File...........................……………...........................................................................29
Function..................……………….........................................................................29
Window.....................……………….........................................................................29
Help ........................................………………..........................................................29
附录......................………………............................................30
附录 A 公式法则…………….…………………………………………..........31
附录 B 多义碱基表.………………..…………………………......................33
附录 C 氨基酸缩写代码……….….………………………………..................34
附录 D 软件上限...…………….…………………………….......................35
附录 E 参考文献.……………….…………………….............................36
附录 F 系统要求……………….………………………………..................37
服务与技术支持.............…………………………….............................................38
其他信息...................…………………….....................................................38
译者后记...................……………………….....................................................38
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版权声明
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版权所有 本说明书中的内容可以
译者声明
本软件说明书著作权归PREMIER Biosoft International 所有 译者则保留中
文翻译的相关版权 并授权生物软件网 www.bio-soft.net 共享发布该说明书的
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为准 译者及生物软件网不承担由翻译 打印 网页等错误带来的直接和间接损失
译者 Wenkelly
电子邮件 [email protected]
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简介
PRIMER PREMIER 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件
级引物搜索
力的理想引物
该软件主要由一下四个主要功能板块组成
GeneTank
Primer
Align
Enzyme
Motif
引物数据库 巢式引物设计 引物编辑和分析等功能 可以设计出有高效扩增能
也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列
序列编辑
引物设计
序列比较
酶切分析
基序分析
新版更新
种间交叉引物设计 利用来自多个物种的序列设计扩增引物
病理检测引物设计 可用来在高保守区域设计引物
等位基因特效引物
设计专用于扩增某一类相关序列中特定成员的引物
基础指南
这段指南并非详细的说明 仅为使用者对
解
四个功能板块都有各自的窗口和菜单 正在使用中的窗口就是您所见到的窗口 以下列出
了各功能板块的主要菜单选项
GeneTank File, Edit, View, Search, Function, Translate, Window,Help.
Primer
Enzyme
Motif
使用功能菜单时
有打开的窗口
所有的列表都有复选功能 对于windows或Power Mac系统而言 在点击同时按住CTRL
键即可将当前的选择加入选单
选项
File, Edit, Function, Report, Graph, Window, Help.
File, Function, Window, Help.
File, Function, Window, Help.
该菜单所属的窗口就会被激活 利用各菜单中的window选项记录的所
可以方便的在各个窗口之间进行切换
按住SHIFT键同时点击 可以选择两次点击之间范围内的所有
PRIMER PREMIER
的菜单选项有一个直观的了
利用它的高
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z GeneTank
利用GeneTank您可以打开DNA或者蛋白质序列 也可以选择不同的阅读框架 共三种
将DNA翻译成蛋白质或利用蛋白序列反推出DNA序列 为方便使用 软件已经提供了普通密
码子列表和几种线粒体密码子列表
器提供了包括多媒体语言校读在内的完整的序列编辑功能
这一功能板块包括以下部分
GeneTank 打开 浏览 编辑及翻译序列
Translation 将打开的序列翻译或反推成其他序列
Edit Codon Table 编辑翻译所依据的密码子列表
GeneTank窗口
GeneTank的窗口用来显示序列及其文件题头信息 序列可以3碱基10碱基一组显示 您
可以将打开的序列翻译或反推成其他序列
前序列
查看序列
选择3碱基或10碱基一组的显示方式 文件题头是指存在于序列文件中 位于序列信息上游的
文字内容
始位置
GeneTank的窗口上也有启用Primer Align Enzyme Motif功能板块的快捷键
点击相应按钮或从View菜单中选择
点击header按钮或从View菜单中选择可以显示文件题头信息 改变5 末端序列起
默认为1 序列将从您指定的5 位置开始显示序列
您也可以输入您自己的其他线粒体密码子列表 序列编辑
您也可以使用通常的拷贝 剪切和粘贴命令编辑当
您可以查看文件题头 改变5 末端序列起始位置
可选操作
View >Show Header
View >Grouping
View > 5’ Seq No
某些版本没有这一项
打开已有序列
使用菜单File >Open
可以激活文件选择对话框 用来打开您希望处理的包含特定序列的
文件
Windows用户请注意
您可以使用其它的任何序列文件类型
默认设置的DNA序列文件后缀为SEQ 蛋白序列文件后缀为PRO 当然
如果序列文件是GenBank的标准格式PRIMER PREMIER会自动识别打开文件中的序列起
始位置
该文件
窗口并显示全部序列
题头
或是您曾经使用本软件菜单中File > Save命令以PRIMER PREMIER默认格式保存过
序列将自动打开 如果打开其他格式的序列文件 将出现一个可卷动的Import Sequence
在序列第一行的起始处双击 则双击处以前的所有信息将被认为是文件
然后PRIMER PREMIER会自动剔除非序列字符并将序列在GeneTank里打开
使用提醒 如果您选错文件 发现并没有您所希望的序列 只需要关闭Import Sequence 窗口
重来一次即可
创建新序列
该项功能可以让您手动键入一个新的序列 您可以键入任何DNA或蛋白序列并存在您指定
的文件夹内
并可以象其他如GenBank格式的文件一样进行操作
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保存序列
使用本软件保存的序列 可以被软件自动识别而无需让您指出序列起始位置 建议您在诸
如以下情况保存序列
您需要经常使用同样的序列
您已经编辑完一段序列并希望保存结果
您已经输入一段新序列
编辑序列
只需在GeneTank窗口内您就可以方便的编辑DNA或蛋白质序列 而编辑翻译或原始序列
十分方便
段蛋白序列上
在相应DNA上的对应三位密码子将同时被删除 但如果您改变一段翻译出的序列 这一改变将
仅仅在另一段由此翻译出的序列而不会出现在原始序列上
剪贴板
通常的剪切 拷贝 粘贴同样可以方便的在此使用 其快捷键分别是CTRL-X, CTRL-C和
CTRL-V
软件提供三碱基一组的显示方式 以利于蛋白相关的工作
在键入DNA序列时可以使用A C G T或者附录B所列出的多义碱基 在键入蛋白序列
时可以使用附录C中所列出的氨基酸单字母记号
在任一序列上的改变将会正确的反应到与之相关的其他序列 例如 如果你在一
无论该序列是被翻译的或是用来反推DNA的原始序列 删除一个氨基酸残基
编辑序列可以使用直接键入或利用
可以从任何文本编辑器如记事本中的剪贴板中拷贝一段序列并将其粘贴进来 当您完成编
辑后请注意保存序列
查找
利用GeneTank窗口上的 Find 按钮 您可以从指针起始位置开始查找序列中一段特定
查找到第一个后 您也可以使用 Find Next 按钮在余下的序列中继续查找 使用Search
字符
菜单
选择Go To Position可以将指针移到您指定的位点
可选操作 某些版本在Edit菜单下
Search >Find
Search >Find Next
Search >Go To Position
查看不同链
要查看该序列的互补链 您只需要点击GeneTank窗口上的A按钮 就会显示该序列的互
补链
式显示
此时互补 而点击S按钮 就能恢复成原来的序列 您亦可点击dsDNA按钮以双链形
可选操作
View > Sense Strand
View > Anti-sense Strand
View > ds DNA
语音校读
在GeneTank打开一段序列后 您可以按下语言按钮启用语音校读功能 序列将从指针所
在的位置开始被依次朗读序列
再次按下语音按钮将停止朗读 按下键入朗读键将在键入的同
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时朗读输入的序列 再次按下该按钮可以停止键入朗读
可选操作
Function > Speaker
编辑序列比较结果
当一项多序列比较完成后 比较结果可以通过编辑来获得更准确的配对 通常ClustalW法
则能够给出一个准确的比较结果
可能有这种需要 所以本软件也提供这一功能 将点击指针指向的碱基可以实施改动 按下空
格键可以插入一个空隙
小同源性参数也会自动改变
按下Delete键则可以删除一个空隙 一旦比较结果被改动 最大和最
因而手工编辑并非必要 但对于个别情况或出于特殊要求
粘贴序列窗口
这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式粘贴上去
分别为正向 As is 反向 reversed 互补 complemented 以及反向互补 reverse
complemented
这样便于从其他程序中粘贴序列而无需考虑其序列保存的方向
参数设置
Preferences 参数设置 窗口可以改变本软件所使用的多种默认参数 也可以允许您查
看及更改引物评分参数
默认引物长度 默认值为25
默认引物长度在Primer Premier窗口使用即点即选功能时得到的引物长度 该项参数也是
Primer Premier窗口启动时的初始默认值这项数值可以设定为1到70个碱基
引物对搜索最大值 默认值为100
在自动搜索引物时 得到的结果数量可以很多 由于该软件按照引物评分来衡量引物效率
有些引物虽然合乎标准但评分较低 可能没有全部列出的必要 尽管我们设置了100对引物这
一较大的数值
核酸浓度 默认值为250 pM
根据文献7 Freier等 提供的计算公式 这是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的总浓
它即不是引物浓度也不是起始模板浓度 而是PCR产物的浓度 由于在PCR过程模板的
度
浓度变化很大
反应中将其当作250 pM
您仍然可以改变该项参数为10到1000之间的任意值
很难确定具体数值 根据文献11 的建议 Rychlik等 一般经验公式在普通PCR
设定二级结构在引物评分中所占的权重系数
这项数值被用来计算引物的退火温度
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单价离子浓度 默认值为50 mM
这项数值是指反应混合液中所有单价离子的总浓度
游离Mg2+离子浓度 默认值为1.5 mM
这项数值是指反应混合液中充当辅基的Mg2+离子浓度
总Na+当量
这项数值是根据单价离子浓度和游离Mg2+离子浓度计算得来 计算公式如下 Sprt即取平
方根
总Na+当量 单价离子浓度 4 Sqrt 游离Mg2+离子浓度 1000
这项数值用来计算引物的退火温度
自由能计算设置温度 默认值为25 °C
这项数值用来计算自由能 G 自由能计算公式为 G= H T S.
评分参数
Rating parameters
级结构越稳定
结构对PCR扩增的影响会更大
能数值
G减去1 这一修正会使3 末端的二级结构显得更加稳定
这一修正值是根据未公开实验结果制定的 您可以根据自己的需要来更改
引物评分就会越低 相对于在引物中间形成的二级结构来说 3 末端的二级
评分参数 窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数 二
为了将这一效应计算在内 软件将3 末端的二级结构的自由
软件只标注是引物二级结构中最稳定的一个自由能数值 G 如果没有检测到二级结构
则该数值为0
序列比较
这一部分仅在Primer Premier的Windows版本中使用 对于Macintosh系统 序列比较是
提交到网上完成并下载比较结果
Align 序列比较 窗口让您将已经打开的序列进行比较 序列选择框显示所有将要比较
的序列
序列比较参数设置
化比较结果的各项参数
一种快速但较粗略 fast/approximate 选择不同的模式将会得到不同的结果
值
使用 Add 和 Delete 按钮可以增加一个序列或移除一个序列
使用 Options 按钮可以打开序列比较的参数设置窗口
您可以利用Alignment Parameters
序列比较可以用两种模式完成 一种准确但较慢 slow/accurate
SLOW/ACCURATE模式的序列比较参数
这些参数无法改变序列比较的运行速度
即最后显示的百分数 并转化为进化树上的进化距离
1 Gap Open Penalty 比较结果中一个空隙的罚分
2 Gap extension penalty 比较结果中一个空隙每延长一碱基的罚分
3 Protein weight matrix 这是描述氨基酸之间的相似性的评分标准
4 DNA weight matrix 为核酸配对制定的评分标准 包括IUB多义密码子
在Primer的教程中有关于这方面的完整信息
序列比较参数设置 窗口来修正ClustalW法则用来优
它们被用来对序列比较评分然后换算为百分比数
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FAST/APPROXIMATE模式的序列比较参数
这种同源性评分是由一种快速粗略的通用比较方法计算得来的
它包括4项参数 有两种
方法用以快速获得序列比较结果
1 只计算准确配对的部分 k-tuples
2 只计算最佳配对的情况
K-TUPLE SIZE 这是默认的准确配对的片段长度 增加这一数值可以提高运行速度 对
于蛋白序列最大值为2
序列
例如大于1000字符 您可能需要增加默认值
对于DNA最大值为4 减少这一数值则可以增加灵敏度 对于较长的
GAP PENALTY 这是快速比较种每个空隙的罚分 若非设定成很大的值 对比较的速度
影响不大
TOP DIAGONALS 在一个虚拟的点划分分析法中 需要计算的在每个对角线上使用的k-
tuple配对数量
这一数值可以提高运行速度
在比较中 只有最佳配对的情况才会被使用 由这项参数指定其数量 增加
减少这一数值则可以增加灵敏度
多序列比较参数
这些参数控制最终的多序列比较
顺序依次进行
权重系数
相应的基本控制参数有两种空隙罚分 gap penalty 以及位置同源或替代的
scores for various identical/nonidentical residues
每个多序列比较包括多个双序列比较的过程 按照预定
1 和2 GAP PENALTY由菜单选项1和2控制
它们设定空隙以及空隙长度造成的罚分增加空隙罚分可以减少比较结果中空隙的数量 增
加空隙长度的罚分可以使空隙更短
末端的空隙不会被罚分
3 DELAY DIVERGENT SEQUENCES 打开这一选项将会先比较同源性高的序列 后
比较同源性较低的序列
该项数值即将特定同源性百分数设定为阀值 低于该同源性的序列将
会推迟比较
4 The TRANSITION WEIGHT 为碱基转换 A< >G或C < >T即嘌呤之间和嘧啶之
间的替换
将其看作一个完全的配对
设定从0到1的权重系数 系数0意味将碱基转换看作一个完全的错配 系数1意味
对于远源序列 建议将其设置为0 而对于同源性较高的序列 将
这一系数适当增加会有好处
5 PROTEIN WEIGHT MATRIX 该选项可以打开一个让你选择权重矩阵 weight
matrices
系列矩阵
的菜单 对于蛋白质分析默认的矩阵是由Jorja和Steven Henikoff 创建的BLOSUM
请注意 是使用一系列矩阵 因为到底使用哪一个矩阵取决于序列之间的同源程度
进化差异不同所使用的矩阵也不同
6 DNA WEIGHT MATRIX 该选项打开一个菜单 选择一个 而不像蛋白分析那样是一
系列
核酸权重矩阵 默认的一个是BESTFIT用来比较核酸序列的矩阵
7 在权重矩阵中 如果您愿意 可以使用正值也可以使用负值 如果不使用NEGATIVE
MATRIX
负值权重矩阵 选项 系统将默认使用正值
8 PROTEIN GAP PARAMETERS 蛋白序列空隙参数选项 可以打开一个菜单让您可
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以设置蛋白序列比较结果的空隙罚分参数 该选项仅在蛋白序列比较中可用
更多信息
如果您想得到关于设置参数和ClustalW法则的更多信息
的完整文件
www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/clustalw.html
请从以下网址获取由原作者提供
序列翻译
激活序列
在GeneTank窗口的一个列表框内显示了原始序列以及由它翻译出的其他序列
产生翻译序列的机制如下
Translated DNA
由蛋白序列反推出的DNA序列
从原始的蛋白序列推导DNA序列 或由原始DNA翻译出蛋白序列 再
注意 如果您多次翻译一段序列 只有最后一次的翻译结果才能被保留 而以前的翻译结果将被
忽略
Translated Protein
从原始DNA翻译而成蛋白序列 或原始蛋白序列翻译出DNA序列
再由DNA序列反推出蛋白序列
推导DNA按钮
当前序列为原始或推导DNA时
激活一个Codon Table Selection窗口
该按钮不可用 当前序列为蛋白序列时 点击该按钮将会
您可以选择密码子列表和阅读框架 翻译结果中的多义
碱基请参照说明书的附录
可选操作
Translate > To DNA
翻译蛋白质按钮
当前序列为原始或推导蛋白序列时
同样将会激活Codon Table Selection窗口
该按钮不可用 当前序列为DNA序列时 点击该按钮
您可以选择密码子列表和阅读框架 如果原序列中
存在的多义碱基使密码子无法翻译成为蛋白残基
可选操作
Translate > To Protein
Edit Codon Table窗口
使用这一窗口
您可以创造新的密码子列表 删除或编辑已有的密码子列表 但PRIMER
PREMIER 提供的标准密码子列表是不能编辑的
使用标准列表
并初始命名为<New Organism 某一数字> 使用Edit Codon Table Name对
该残基位点会用*号代替
使用 ADD 按钮创建新的密码子列表会
12
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话框可以编辑列表名称 使用 DELETE 按钮则删除当前列表 要改变某一密码子对应的氨
基酸
正对其操作
只需要用鼠标将其拖放到相应位置就可以 点击密码子时鼠标指针会发生变化 提示您
任何拖放操作会改变两行内容 一行 即某种氨基酸 得到一个密码子的同时
另一行失去这个密码子
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z
Primer
引物设计
Primer功能板块包括了设计引物的搜索引擎
单的操作就可以得到合适的引物
于根据您的特殊要求制定标准
二级结构
引物的比吸光度
入数据库打印或填写引物合成定购单
为设计用于定点突变的引物 该项功能板块也提供包括即使分析和限制性酶切位点分析的
引物编辑工具
为分析多对反应引物 如在复式及巢式PCR中 使用function菜单下Multiplex/Nested选项
您可以分析所有想用到的引物
存到数据库的功能
重要信息
该项功能板块由以下部分组成
Preferences
Primer Premier
Edit Primer
Search Criteria
Search Parameter
Search Results
Multiplex/Nested Primer
Database
Synthesis Order Form
Reports
Graphs
关键参数如Tm值
activity
您可以通过输入碱基或氨基酸残基来手动修改引物
也提供填写引物合成定购单的功能 定购单上会自动填入引物序列和其他
参数设置 窗口
引物编辑 窗口
引物数据库 窗口
结果报告
图表
单位nmoles/OD和ug/OD 及引物的分子量 还可以将当前引物输
引物设计 窗口
搜索标准 窗口
搜索参数 窗口
搜索结果 窗口
PRIMER PREMIER
输出的引物通过全面的即时分析工具计算出引物的多种参数和
GC含量和自由能 G还能以图形显示
可以选择事先搜索的引物或手动添加引物 软件提供将引物储
复式及巢式
生成引物合成订单
PCR
软件包含了强大的自动搜索法则 只需要简
也提供了人工控制搜索引擎的方法
还有另一个窗口来显示
引物设计 窗口
便
Primer Premier 引物设计 窗口
Primer Premier
Select
Direct Select
置最接近点选位置并与原序列互补的引物所有引物性状将即时更新
记上以区分引物的扩增方向
与某一特定序列有哪些错配位点
在序列比较中应用即点即选功能
很容易知道引物与每一特定序列有哪些错配位点
引物并加以分析
因的引物
Consensus
引物性状列表和二级结构显示 具体介绍如下
当您将鼠标指针移至该框中
如果点选一组序列比较结果 引物序列将依据保守序列来确定 这使得您很容易知道引物
在利用高保守序列区域设计引物时
通过
引物设计 窗口是分析引物的关键 该窗口包括以下功能 即点即选
即点即选 框
指针将变为铅笔型 点击框中任何一处 会产生一条起始位
引物5和3末端也会标
Primer Premier会在引物窗口显示序列比较
点击序列任一地方将根据保守序列产生一条
引物也可以被编辑以便同某一特定序列匹配 这些可以用来设计针对等位基
View
切换到显示少数分歧碱基可以看出哪些核苷酸不能很好的与所有序列匹配
菜单选项可以切换显示多数倾向和少数分歧碱基
14
Majority or Minority
Direct
这样您
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性状列表
这一列表显示了当前引物对的各种性状
您可以通过以下三种方式选择一对引物作为当前
引物对
Direct Select框
选择反向引物
得到一对引物对
根据上述使用Direct Select的方法选择一条引物 切换到另一条互补链
在Search Results 搜索结果 窗口里选择一对引物对
使用输出命令在数据库窗口里选择一对引物对.
注意 如果您想使用上述方法选择一条例如如正向引物而不是一对引物 您需要手动回复原来的
反向引物来和新引物配对
T
GC含量 GC%
性状列表能自动更新正反引物的长度
义性
长度
比吸光度
a
而T
Optical Activity
Opt项显示了PCR反应适宜的退火温度
起始位置 融链温度
单位ug/OD 对于引物对来说 长度条显示了PCR产物的
各种引物性状计算公式请参阅附录A
m
二级结构
PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构
些二级结构
也显示二级结构的自由能数值
而按下的按钮表明相邻的图框里显示的是何种二级结构 除了二级结构 图框里
G
单位kcal/mol
注意 如果有至少连续三个碱基配对 就会被认为能形成发卡 二聚体或错配之类的二级结构
在左下的两排按钮可以想您显示发现了哪
多
在PRIMER PREMIER窗口内的图框里显示的是最稳定的二级结构 连续碱基配对用实线
显示
而不连续碱基配对用虚线显示 按下按钮
择正向引物的发卡结构
并点击
All
就会显示以下内容
All
就会给出当前二级结构的报告 您选
可能出现的二级结构按照稳定性大小自动排序 最稳定的一种排在最前 使用卷动条可以
看到未显示的部分
除了上述功能 这一板块还具有激活以下功能的快捷按钮
窗口
Search Results
搜索结果 如果已经实施过搜索 窗口以及Edit Primer 引物编辑
Search Criteria
窗口 点击按钮可以使相应部分伴随引物对以图形显示
搜索参数
15
Page 16
Edit Primer 引物编辑 窗口
Edit Primer
在windows系统或Power Mac的Command-X
使用CTRL-X
剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法
将引物序列转化为反向
发生变化
您可以修改实际序列或是翻译后的氨基酸残基 如果您修改氨基酸残基 相应位置可能出现多
义密码子
除了上述的引物性状和二级结构资料 具体参阅PRIMER PREMIER窗口的章节 该窗
口也提供了限制性酶分析功能
选方案来选择一组限制性酶
引物编辑 窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列
CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切
互补或反向互补形式 您也可以手工键入引物序列 一旦引物被编辑
Analyze
按钮就可以使用 点击
您可以通过点击
Command-C
拷贝和粘贴 删除当前引物序列 并从
进行粘贴时
Analyze
Enzyme
及Command-V系统中 您可以
Paste
按钮即可分析编辑后的引物
按钮 通过手动或软件提供的筛
粘贴 窗口会激活 用以
您可以使用
认是否有其它比当前位点更稳定更适合的结合位点存在
其他信息 如果您希望改变阅读框或使用其它密码子列表 请关闭本窗口 从主菜单上选
Function >GeneTank
择
Select Codon Table
可选操作
Function > Edit Primer
Prime
窗口来改变阅读框或选择其它密码子列表然后重新打开本窗口
按钮来将引物移动到更合适的结合位点 通常这项功能可以让您确
激活
GeneTank
窗口
再选择
Translate > Change Parameters
Search Criteria 搜索标准 窗口
以下是基本搜索标准的详细信息
PCR
根据
PRIMER PREMIER 会根据您的选择来调整自动搜索的标准
标准不一定也适合测序引物或杂交探针的设计
择不同的搜索标准
中使用的具体参数请参看后面的
Search Type
当前引物找寻合适的反向引物
引物 测序引物或杂交探针的不同要求 选择不同的搜索标准是很有必要的
某些用以优化引物扩增能力的
这两者需要的是较高的退火温度 因此当您选
PRIMER PREMIER将对相关标准作出调整以适应不同的要求
Automatic Search Parameter
搜索类型框 将指定您要搜索的是单个引物 两条单独引物 引物对或为
自动搜索参数 章节
打开
搜索公式
默认设置下
500 bp
到
引物长度 您将会在下一章节了解该项设定的具体作用
最后您可以设定
全控制特定的搜索参数
中通过详细分析来挑选合适的使用
可选操作
Function > Search
Search Range
如果您是搜索单个引物 该数值将不会起作用 您也可以为搜索设定
Search Mode
建议您使用自动搜索 利用PRIMER PREMIER找到多条引物 再从
搜索范围 是当前序列的全长 默认PCR产物长度为100 bp
搜索模式 为自动或手动 除非您有很特殊的要求或想完
16
Primer Length
Page 17
Search Parameter Windows 搜索参数窗口
搜索可以使用其它的自动搜索方法或者手动搜索
当您希望搜索的引物不会与其它存在与反应中序列发生错配 您可以在激活False Priming
选项后
利用
Files
按钮选择这些序列文件
Automatic Search
PRIMER PREMIER
尽管
用哪些参数
自动搜索开始的标准很严格 但如果没有找到合适的引物 则标准会自动降低直到找到合
适的引物
根据指定搜索范围中所有可能引物的Tm平均值确定的
点击去掉相应参数左边框中的 则该参数在搜索中不会被考虑
下列图表中显示了在PCR引物设计中自动搜索初始的严格参数 其中Tm值范围是
自动搜索
已经自动设置了一些数值 您还是可以选择在自动搜索中需要使
如果您是搜索测序引物 则相应参数会有所不同 具体列表如下图
17
Page 18
如果您是搜索杂交探针 则相应参数如下图
其他信息 如果您选择手动搜索 并点击Stringency 严格度 按钮 您会得到类似以上的自动
更新的图表
Manual Search
在过去十年中
构和适宜长度的了解使得我们在保证引物特异性的前体下
PRIMER PREMIER
手动搜索 及引物设计原理
为获得高效扩增
PCR方法得到的很大发展
我们对引物稳定性 二级结
大大提高了引物的扩增效率 而
软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡
引物长度
引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度 对越多数实验 适宜引物长
度为18到24个碱基
等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建
library protocol 28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样
本的克隆能起到重要作用
退火温度来能提高反应的灵敏度
长
PCR
引物能给扩增带来更好的特异性 长引物也允许您通过降低
不过长引物通常更易于形成包括发卡结构 二聚体 自身互
补等二级结构
理论上 在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡
PRIMER PREMIER 已经包含了合适的引物长度范围
动记录并在下次使用
直到您再次改变它们 因此 您最好根据不同实验的特殊要求输入合适
如果您改变了它们 软件将会自
的长度范围
PRIMER PREMIER
范围或GC含量不符合要求
符合要求
如果引物长度达到最大值还不能符合要求 则该引物将会被剔除 这种搜索机制保
证找到的引物是符合
以最短的指定长度开始搜索引物
它将给引物增加一个碱基长度并重新计算
T
m
值和GC含量要求的最短引物
为设计一条高效引物 有几个参数必须考虑
如果找到的引物的
T
m
值和GC含量看其是否
PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次
T
m
值小于设定
如下
Tm
融链温度
PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论 nearest neighbor theory
来计算融链
18
Page 19
温度 请参看附录A中关于公式的说明 选择的Tm范围应该为退火提供足够的热度 在自动搜
索中
PRIMER PREMIER使用的范围选择机制如下
首先 计算出指定搜索范围中所有可能引物的Tm值 得出平均值后 按照不同的严格度
要求确定的波动值
根据已发表的实验数据 文献8
根据这一平均值来计算出Tm范围
PCR反应的合适T
m
范围为56到63°C 以上机制是被设
计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物
GC% GC含量
对于PCR反应来说
含量至少应为
50%
GC含量在50%左右比较合适
请参看上文
Automatic Search
而对于测序引物和杂交探针来说
章节中的图表标明的各种搜索方法使用的具
GC
体参数
Degeneracy
多义性
当设计多义引物时 应尽量减少引物多义性 这样会带来更好的特异性 应尽量避免3
末端的多义性 因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸 详情请参看本说明的
Degeneracy
3’ End Stability
多义性 章节
3
末端稳定性
引物稳定性影响它的错配效率 一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对
稳定性较弱的3
形成非特异性扩增条带
配
末端 如果引物3 稳定性强 有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错
secondary bands
而3 末端稳定性低的引物较好的原因是
在引物发生错配时 由于3 末端不太稳定 引物结合不稳定 而难以延伸
GC Clamp GC钳
引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端 这一段有较强稳定性的5 末端称为GC
它保证引物与模板的稳定结合 选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的
钳
前提下尽量降低退火温度
使用菜单Report > Internal Stability选项可以看到象下图所显示的
一个引物的内部稳定性曲线表
19
Page 20
请注意 上图就显示一个好的引物
Repeats and Runs
重复和循环
3
末端稳定性较弱 而5 末端有一个较强的GC钳
PRIMER PREMIER自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物
ATATAT这样AT被重复三次
那么这个引物将被剔除 您可以设定可以接收的碱基重复的数量
例如引物包含
Secondary Structures
二级结构
二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素 二级结构能显著影响反应中能与模板正
确结合的引物数量
发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力从而降低扩增效率 形
成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用
Hairpin
发卡结构
发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构 并
由于发卡结构的形成是分子内的反应
定性可以用自由能衡量
要的能量
如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应 如果自由能值小于0 则
该结构可以干扰反应
功能
帮助您回避类似二级结构
Dimer
二聚体
自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需
按下按钮
仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成 发卡结构的稳
All
可以使用PRIMER PREMIER软件中的Hairpin Report
引物之间的配对区域能形成引物二聚体 它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结
它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物 二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向
构
引物之间形成
体扩增
使用Dimer Report功能可以预测二聚体的形成
False Priming
如果配对区域在3 末端 问题会更为严重
错配
3
末端配对很容易引起引物二聚
如果引物可以结合除目的位点外的其他区域 扩增效率将明显降低 目的产物带将减少或
出现涂布
局部的错配
配对
smear PRIMER PREMIER会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成
3
末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基
您可以分别设定确认为错配的3末端或引物全长形成连续碱基配对的数量
Pair Rating
匹配度低的引物对常常不太有效 是因为 在同样退火温度下
异性
而
每一对引物的匹配度
匹配度评分
T
m
高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始
100分为满分
并按照分数按降序排列 计算引物对匹配度以及单个引
T
m
低的引物决定扩增的特
PRIMER PREMIER
会计算
物评分的公式请参看本说明的附录
Search Results 搜索结果
当您点击搜索程序窗口的
口将会打开
它显示了搜索中找到的所有引物或引物对 如果您选择了一条引物或一对引物对
OK
按钮接受搜索结果后
在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果 与当前的序列配对的引物的位置和
序列也会在
Direct Select
其他信息 Search Results窗口的位置和大小是可以调节的 这样在其他窗口里您感兴趣的显示
内容 如引物分析结果 就不会被遮住了
框上显示
可选操作
Function > Search Results
20
Search Results
搜索结果 窗
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Multiplex/Nested Primer 复式及巢式PCR反应引物 窗口
巢式PCR反应通常能大幅提高灵敏度同时又减少非特异性扩增产物 通常在模板DNA浓
度太低或不纯时采用
要求的引物
引物
当您接受搜索结果 选择菜单Function >Multiplex/Nested Primers选项即可打开该窗口
所有引物与全序列以图形显示在窗口顶部 序列上的框架代表窗口中间放大显示的部分序列所
在的位置
的图框显示
表反向引物
点击三角形即选定一条对应的引物应用于您的巢式PCR反应 同时三角形由空心变为实心
表明已被选中
已选引物间可能存在的交叉二聚体也同时显示出来
时
的已选引物并显示它们之间间可能存在的交叉二聚体结构
组没有或很少有稳定的交叉二聚体的引物
心三角形就可以了
也可以手动添加所有的引物
核酸作为正向引物还是反向引物
末端第一个碱基 如果想删除一条引物 只需选定并点击
您可以打印模板序列及所有的引物 已选引物显示为实心三角形 未选引物显示为空心三角形
列表包含的引物以及所有可能的交叉二聚体结构也同样被打印出来
PRIMER PREMIER可以确认它们是否会形成二聚体来帮助您选择巢式PCR反应
通过拖动横行滚动条可以改变放大显示的区域 所有提供的引物以竖线形式在顶部
以蓝色三角形或红色三角形在下面的放大框中显示 蓝色代表正向引物 红色代
选中的引物会在下面的图框中以图表形式显示 您会看到 在您选择引物的同
您可以使用自动搜索或按您实验的需要搜索 然后从中选择一系列合乎
PRIMER PREMIER
您可以继续选择引物直到您找到一
要剔除一条已选引物非常简单 再次点击对应的实
您也可以手动添加一条引物 这样便于您使用已有的引物或通用引物 您
并分析它们之间的能否形成交叉二聚体 您可以指定输入的寡聚
它们的起始位置和序列 如果不指定起始位置 则默认为5
Delete
按钮
能即时分析所有
Database 引物数据库 窗口
引物数据库可以用来保存引物序列 您可以为每一条引物命名 并保存在一个原有的或新
建的数据库中
法可以将已选的引物输入到数据库中
在数据库窗口中 您可以使用Order Primers按钮来定购引物 有两种主要方
您可以在Search Results窗口中标记想选择的引物 然
21
Page 22
后在引物数据库窗口中使用Get Marked Primers按钮将标记的引物全部输入到数据库 另一种
方法是您直接选择一条或一对引物
数据库
引物数据库可以保存引物的起始位置 序列 对应链和引物名称 选择一条引物 使
用菜单的编辑选项或点击本窗口的快捷按钮可以编辑引物的起始位置
再利用Current Primer Pair 当前引物对 图框将其输入
序列 对应链 即方向
和引物名称
从下拉菜单里选择一个引物数据库 您可以使用
当前序列上进行分析
分析
您可以使用
在引物被选择后 您可以使用PRIMER PREMIER窗口对其进行编辑和
Edit Primer
窗口上的
prime
Import
按钮输入以往保存的引物并在
按钮在当前上序列寻找最佳的结合位点
您可以添加一个新的数据库并命名区分 这样便于您依照不同的项目或模板序列将保存引
物信息
您也可以同样便利的删除一个数据库
使用
始位点
Add Primer
按钮可以添加一条新引物 同时激活一个窗口用来填写引物名称 起
对应链和引物序列 如果不指定起始位置 则默认为5 末端第一个碱基
Reports 分析报告
使用Reports菜单可以提供多种分析报告 除了在PRIMER PREMIER窗口下也可以直接
打开的二级结构报告
菜单下的Optical Activity选项能打开一个报告窗口
activity
单位nmoles/OD和ug/OD
也可以提供当前引物的内部稳定性图表和比吸光度报告 选择Reports
显示当前引物对的分子量和比吸光度
当您在内部稳定性图表上移动鼠标指针 将会显示一条贴近最近的序列的分界线 而数据
输出窗口也会即时更新
而相应五聚体会高亮显示 该图表窗口可以调整大小以便看清细节
当您选择Reports菜单下的Hybridization Time 杂交时间 选项您可以输入引物的长度和
浓度
点击
Analyze
按钮可以得到杂交时间
Synthesis Order Form 合成订单
在搜索及分析完引物后 如果您决定定购合成该引物 您可以使用软件生成订单 为方便
您使用
并命名保存 您可以使用这个订单作为今后的订单模板
以用来选择您想合成的引物
PREMIER 将在合适的位置自动添加您选择的引物
可以加上您的注释
软件已经有一个现成的模板 您可以创建一个新订单 并输入您的地址和其他信息
只需选择您想合成引物 点击
Database window
Order Primer
数据库窗口 可
的快捷按钮
并附上地址及其他信息生成一张订单 您
并将其打印送出 您可以保存该订单便于以后查看
PRIMER
Optical Activity 比吸光度
引物对于260nm波长紫外光的吸光度 即A
0.02
Molecular Weight
分子量列表计算得出的
nmol/A
系数和分子量列表计算得来的
ug/A
列表计算得来的
软件也能计算引物的分子量 以便计算如何稀释新合成的引物
分子量 正反引物分子量均以grams/mol 克/摩尔 为单位 这是根据
260
在260nm波长紫外光下 每单位吸光度代表的引物的纳摩尔数量 这是根据吸光
260
在260nm波长紫外光下 每单位吸光度代表的引物的微克数量 这是根据吸光系数
260
与其浓度成正比
22
1mg/mL的DNA吸光度为
Page 23
Degeneracy 多义性
某些PCR实验需要引物结合到不确定的序列 例如下列情况
知道表达蛋白的序列但是不知道DNA序列
模板DNA测序结果不准确或不完全
利用其他生物体已确认的序列来扩增某一编码区
利用模板的同源序列设计引物
在设计多义引物时 除了在上述搜索参数章节提及的一般参数外 也要考虑引物的多义性
多义性尽可能低的引物有更高的特异性 因而更为理想 尽量避免3末端的多义性也很关键
因为3 末端即使一个错配也会抑制延伸
末端多义碱基比例和数量都较少的引物 参见文献13
在3
PRIMER PREMIER 能自动搜索模板序列
设计出
有报道说PCR程序能显著改变多义引物扩增的成功率 该种优化程序开始的2
采用不严格的退火温度
允许部分配对的引物与模板结合
好的作为以后扩增的模板了
然后的25到40个循环使用更为严格退火温度 宽松的退火条件可以
在两个循环后 扩增产物的5末端就与引物一致 并能很
此时提高退火温度能得到更高的特异性
Graphs 图表
通过Graph菜单可以获得整个序列Tm融链温度
T
内部稳定性 的图表
参数
设定的
GC%
m
是所有可能的引物的融链温度 引物长度是由Preferences 默认
则是所有可能引物的GC含量
一序列位点起始的五聚体的稳定性自由能
一条贴近最近的序列的分界线
而数据输出窗口也会即时更新 而相应五聚体会高亮显示
当您在内部稳定性图表上移动鼠标指针 将会显示
GC% GC含量
Internal stability
内部稳定性 则是在每
5个循环
和Internal stability
23
Page 24
Restriction Enzyme
z
Analysis
限制性内切酶分析
PRIMER PREMIER 为您提供的限制性内切酶的分析功能包含约900种酶
具让你您方便的添加其他酶
的群组使用
组来进行限制性内切酶分析
列
这一功能板块有下列几个部分
Restriction Enzyme Analysis Window
Filter Window
Edit Window
此外您可以根据限制性内切酶特性使用特征筛选来创建新的群组 并作为当前群
特征筛选窗口
编辑窗口
通过从默认群组中选择或剔除限制性内切酶 您可以创建一个新
限制性内切酶分析可以采用以下几种格式显示 列表 图谱或序
限制性内切酶分析窗口
Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析 窗口
PRIMER PREMIER 为您提供的限制性内切酶分析功能包含约900种酶
编辑从
Enzymes
分析
Mac系统而言
两次点击之间范围内的所有酶
Enzymes
Enzymes
征筛选窗口
All Enzymes
框显示了当前使用的群组包含的酶 它是全部酶的子集 被用来做限制性内切酶的
有两种方法可以用来选择当前群组
1
2
All Enzymes
从
在点击同时按住CTRL键即可选择多个酶 按住SHIFT键同时点击 可以选择
框中选择酶并点击
框中双击某个酶即为添加 在
使用特征筛选窗口根据某些特征来选择当前群组 具体请看下面的Filter window 特
的章节
全部酶 中添加或删除一些酶作为当前使用的群组
框中选择您想添加的酶 添加到当前群组中 对于windows或Power
Delete
Add
按钮将选中的酶加入到当前群组 在
按钮可以从当前群组中剔除特定酶 同样在
Selected Enzymes
框中双击某个酶即为剔除
使用
同时也提供工
您可以启用群组
Selected
Selected
All
Restriction Sites 酶切位点 窗口
在Restriction Enzyme Analysis窗口点击
选显示方法有
Table
置
Sequence
Map
Non-cutters
您通过指定切点数量限制 来有选择的显示酶切分析结果 例如您点选
点多于或等于5个的酶将不会被显示
注意 如果某个酶的切点多于50个 将只显示前50个 其余的则被忽略
使用菜单的File >Print 您可以打印以Table
列表 以表格形式列出酶 识别序列和切割位点 以及在待分析序列上的切割位
序列 显示所有酶在分析序列上的实际切割位点
图谱 以长条形式显示序列 在其中使用竖线表示所有的酶切位点
无切点酶 列出所有在序列上没有切点或不符合预设参数的酶
OK
按钮可以打开Restriction Sites窗口 可
Sequence 或 Non-cutters 形式的分析结果
Edit Enzyme 限制内切酶编辑 窗口
想要在All Enzymes群组中修改某一种酶 选择该酶并点击
Enzyme
限制性内切酶编辑 窗口 在这里 酶的名称 识别位点和热稳定性都可以修改
4
Edit
按钮 可以激活Edit
数字框 切
24
Page 25
点击
按钮则可删除选定的酶 点击
Window
Add
按钮可以激活新内切酶窗口 其名称和识别位点采用默认设置 点击
OK
按钮则保存所有修改并返回Restriction Enzyme Analysis
限制性内切酶分析窗口
注意 您无需每次修改都点击 OK 按钮 软件能记住您这一次的所有修改 点击 OK 按钮
可以保存所有修改 而点击 Cancel 按钮则放弃所有修改
Filter 特征筛选 窗口
您可以使用特征筛选窗口 根据酶的特征来选择当前群组进行分析
Delete
选择相应的数字框 在4碱基到13碱基的范围内指定酶的识别位点
内会即时更新为只包括符合条件的酶列表
端序列
的当前群组
下面的图表举例说明了粘端类型
点选
当您点击
Heat Inactivation
OK
按钮后
并将使用该群组进行限制性内切酶分析
框您也可以指定酶群组是否能被热灭活
Selected Enzymes
您可以根据需要指定粘端
框内包含的内切酶列表将成为酶切分析使用
Selected Enzymes
overhang
类型及粘
框
25
Page 26
Motif
z
软件为您提供了包括约165种常用基序的分析功能 同时也提供工具让你您方便的添加其
他基序
来进行基序分析
这一功能板块有下列两个部分
Motif Analysis Window
Edit Window
Analysis
通过从默认群组中选择或剔除基序 您可以创建一个新的群组使用 并作为当前群组
基序分析可以采用以下几种格式显示 列表 图谱或序列
编辑窗口
基序分析
基序分析窗口
Motif Analysis 基序分析 窗口
PRIMER PREMIER
All Motif
示了当前使用的群组包含的基序
来选择当前群组
从
系统而言
次点击之间范围内的所有基序
Motif
框中双击某个基序即为添加 在
框中选择基序并点击
全部基序 中添加或删除一些基序作为当前使用的群组
All Motif
在点击同时按住CTRL键即可选择多个基序 按住SHIFT键同时点击 可以选择两
框中选择您想添加的基序 添加到当前群组中 对于windows或Power Mac
为您提供的基序分析功能包含约
Delete
它是全部基序的子集 被用来做基序分析 可以用下述方法
使用
Add
按钮将选中的基序加入到当前群组 在
按钮可以从当前群组中剔除特定基序 同样在
Selected Motif
框中双击某个基序即为剔除
165
种基序
您可以启用群组编辑从
Selected Motif
Motif Sites 基序位点 窗口
在Motif Analysis窗口点击
Table
Sequence
Map
Motifs Absent
列表 以表格形式列出基序 基序序列和数量 以及在分析序列上的位置
序列 显示所有基序在分析序列上的位置
图谱 以长条形式显示序列 在其中使用竖线表示所有的基序的位点
不存在的基序 列出所有在序列上没有或不符合预设参数的基序
OK
按钮可以打开Motif Sites窗口 可选显示方法有
框显
Selected
All Motif
您通过指定基序数量限制 来有选择的显示基序分析结果 例如您点选
现多于或等于5次的基序将不会被显示
注意 如果某个基序出现多于50次 将只显示前50个 其余的则被忽略
使用菜单的File >Print 您可以打印以Table
Sequence 或Motif Absent 形式的分析结果
Edit Motif 基序编辑 窗口
想要在All Motif群组中修改某一种基序 选择该基序并点击
基序编辑 窗口 在这里 基序的名称 识别位点和基序说明都可以修改 点击
钮可以激活新基序窗口
的基序
点击
注意 您无需每次修改都点击 OK 按钮 软件能记住您这一次的所有修改 点击 OK 按钮
可以保存所有修改 而点击 Cancel 按钮则放弃所有修改
OK
其名称和识别位点采用默认设置 点击
按钮则保存所有修改并返回
Motif Analysis Window
Edit
按钮 可以激活Edit Motif
Delete
按钮则可删除选定
基序分析窗口
4
数字框 出
Add
按
26
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Menu Commands
以下功能板块都有自己的主菜单
GeneTank 主菜单
Primer Premier 主菜单
Enzyme Results 主菜单
Motif Results 主菜单
菜单命令
GeneTank 主菜单
File
New Sequence
Open Sequence
Save
您就可以打开一个这样保存的文件
Save As
Degenerate Bases
Print
Quit
最近打开的四个文件列表
Edit
通常的剪切
Preferences
将当前序列保存为一个文件 无需经过Import Sequence 窗口确认序列起始位置
将当前序列另存为指定文件
使用不同格式及组合进行打印
退出PRIMER PREMIER
重新打开一个序列空白的
提示您使用一个文件来打开已有序列
给出所有可用多义碱基的列表及其含义
cut
复制
让您选择软件种使用的各种参数 某些版本该选项在File主菜单下
copy
和粘贴
GeneTank
paste
选项
窗口
View
Show Header
Sense Strand
Anti-sense Strand
ds DNA
Grouping
5’ Seq no
捷按钮
Search
Find
Find Next
Go To Position
Function
Primer Design
Restriction Enzymes
Motifs
Bias majority by
Speaker
这一主菜单下的选项 除了当前使用的功能外都可选
注意 某些版本没有该主菜单 相应选项在Edit主菜单下
从当前位置开始在序列中查找特定序列段
即根据预设参数进行基序分析
显示在GeneTank窗口打开的当前序列的文件题头
显示当前序列的正链
显示当前序列的负链
显示当前序列的双链
选择3个碱基一组或10个碱基一组的显示方式
指定序列5 端起始位置并重新排序 某些版本没有该选项 但在窗口上有快
在序列中查找特定序列段的下一个出现位置
将指针移动到序列的指定位置
选择该功能即根据预设参数开始设计引物
即根据预设参数进行限制性内切酶分析
当某一碱基不保守时 倾向以哪一序列为准
语音校读
27
Page 28
Translate
To DNA
To Protein
Change Parameters
Edit Codon Table
Window
这一主菜单列出除当前窗口外
Help
使用这一菜单查阅帮助文件
并包含超链接 便于您快速转至相关主题 也可以使用搜索功能寻找主题
从当前蛋白序列反推DNA序列
将当前DNA序列翻译为蛋白序列
改变翻译的阅读框或密码子列表
添加 删除或修改密码子列表
已打开的所有窗口 选择其中一个将切换到对应窗口
帮助文件中的信息与本说明大致一样 帮助以屏幕格式显示
Primer 主菜单
File
Preferences
Degenerate Bases
Print
Quit
Edit
Find
Find Next
使用不同格式及组合进行打印
退出PRIMER PREMIER
在序列中查找特定序列段
让您选择软件种使用的各种参数
给出所有可用多义碱基的列表及其含义
在序列中查找特定序列段的下一个出现位置
Function
Search
Search Results
口
Edit Primer
一个最适合的错配位点
Multiplex/Nested
删除新引物并放在已选择引物群组中分析
Database
位点
在以上菜单的分界线以下 还列出了另外三个功能板块
Report
Hairpin
Dimer
False Priming
Internal Stability
Optical Activity
Hybridization Time
Graph
Melting Temp
GC %
Internal Stability
打开Search Criteria window 搜索参数窗口 设定参数并开始搜索引物
如果已实施搜索 该选项将激活Search Results window 搜索结果窗
您可以添加 删除和修改引物序列并进行即时分析 也可以将引物移动到下
从搜索结果中选择相匹配的一组复式或巢式
添加 删除或修改引物数据库 修改其中的引物的名称 对应链 序列及起始
也可以生成引物合成订单
显示所选的正向或反向引物的所有发卡结构
显示所选的正向或反向引物的引物所有二聚体结构
显示所选的正向或反向引物的所有错配位点
绘出所选的正向或反向引物的内部稳定性图表
显示引物的分子量及比吸光度
针对特定长度和浓度的引物 计算杂交时间
Tm
绘出全序列的引物GC含量图表
绘出全序列的引物Tm 图表
绘出五聚体的稳定性图表 单位Kcal/mol
PCR
引物 也可以添加或
28
Page 29
Window
参看Gene Tank相关说明
Help
参看Gene Tank相关说明
Enzyme Results 主菜单
File
Preferences
Degenerate Bases
Print
Quit
Function
Primer Design
Restriction Enzymes
GeneTank
Motifs
Window
参看
使用不同格式及组合进行打印
退出PRIMER PREMIER
Gene Tank
让您选择软件种使用的各种参数
给出所有可用多义碱基的列表及其含义
选择该功能即根据预设参数开始设计引物
即根据预设参数进行限制性内切酶分析
GeneTank
显示
即根据预设参数进行基序分析
相关说明
窗口
Help
参看Gene Tank相关说明
Motif 主菜单
File
Preferences
Degenerate Bases
Print
Quit
Function
Primer Design
GeneTank
Restriction Enzymes
Motifs
Window
参看
Help
参看
使用不同格式及组合进行打印
退出PRIMER PREMIER
Gene Tank
Gene Tank
让您选择软件种使用的各种参数
显示
即根据预设参数进行基序分析
给出所有可用多义碱基的列表及其含义
选择该功能即根据预设参数开始设计引物
GeneTank
相关说明
相关说明
窗口
即根据预设参数进行限制性内切酶分析
29
Page 30
附录 A 公式法则
附录 B
附录 C
附录 D
附录 E
附录
多义碱基表
氨基酸缩写符号
软件上限
参考文献
F
系统要求
附 录
30
Page 31
附录 A 公式法则
计算公式
引物融链温度T
m
融链温度的计算基于相邻二碱基对热力学理论
theory
算法则
T
m
计算公式出自与Freier 等发表的文章 文献7 这些是高度精确的相邻二碱基对Tm 计
为得到尽可能准确的计算结果 对公式进行了部分修正
= H/ S + R ln C/4 + 16.6 log [K+]/ 1 + 0.7 [K+] - 273.15
nearest neighbor thermodynamic
H 是螺旋结构的焓值
S 是螺旋结构的熵值
C 是DNA浓度
[K+] 是盐浓度
每一条寡聚核苷酸的 H 和 S 根据Breslauer K.J.提出的理论 文献2 计算 由于
Breslauer
K.J.使用的热力学计算方法是在1M的Na
根据盐浓度修正公式
以下公式计算
Sprt即取平方根
条件下 所以有必要加入一个参数[K
+
[K+]的计算要同时考虑反应体系中的单价离子和游离Mg2+[K+]数值由
+
]来
[K+] 单价离子浓度 4 Sqrt 游离Mg2+离子浓度 1000
盐浓度即[K+] 在参数设定 preferences 中也称为Na+ 当量 会根据单价离子和游离Mg
浓度而自动更新 默认单价离子和游离Mg2+T浓度分别为50.0 mM 和 1.5 mM 这样总盐浓度
等于204.9 mM
在文献7 Freier et al. 提供的计算公式中 C值是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的
总浓度
板的浓度变化很大
验公式在普通PCR反应和测序反应中将其当作250 pM
它即不是引物浓度也不是起始模板浓度 而是PCR产物的浓度 由于在PCR过程模
很难确定C的具体数值 根据文献11的建议 Rychlik, W. et al. 一般经
通过File菜单下的选项 您可以打开
Preferences窗口来修改这项预设值
2+
产物融链温度Tm的计算公式
由于相邻二碱基对
的融链温度不能使用该模型提供的公式来计算
nearest neighbor 模型只适用于例如引物的寡聚核苷酸 PCR产物
计算较长的双链DNA 可以使用Wetmur
文献12 的公式
产物Tm=81.5 + 16.6 log [K+]/ 1+0.7[K+] + 0.41 %G + %C - 500/length
盐浓度即[K
] 在参数设定 preferences 中也称为Na+ 当量 也是由上述公式得来 产
+
物的GC% 和长度也要考虑在内
最适宜退火温度计算公式T
PRIMER PREMIER 使用Rychlik的公式
PCR反应的退火步骤使用该优化退火温度
Opt
a
文献11 自动预测引物对的优化退火温度 在
能提高目的产物产量并减少错误的产物
Ta Opt = 0.3 引物Tm+ 0.7 产物Tm– 25
在公式里的引物T
链温度
计算方法参看上述相关章节
是相对不稳定的引物 产物对的融链温度 产物Tm则是PCR产物的融
m
31
J.G.
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自由能
Watson-Crick DNA的相邻二碱基对作用
G计算公式
焓值和熵值的计算是基于Breslauer等
文献11 建立的热力学参数集 其中包含共10种
nearest-neighbor interactions 模式 根据这种方
法一段寡聚核苷酸的自由能可由其中每一双核苷酸的焓值和熵值以及预设参数中指定的温度计
算出来
该预设温度可以在Preferences窗口根据实际的环境温度进行修改 该实验特指在1M
NaCl浓度下的PCR反应
G = H – T S
H 为焓值
T 为温度
S 为熵值
3
末端和内部的配对都能形成二级结构 而3 末端封闭的二级结构对扩增效率的影响更
大
考虑到这一点 3 末端的二级结构自由能 G值将减去1
单个引物评分
Rating = 100 -
Rating
公式
G Dimer 1.7 + G Hairpin 1.4 + G False Priming 1.5
评分 100 - 二聚体 G 1.7 + 发卡 G 1.4 + 错配 G 1.5
当引物搜索完成后 一般很难判断可供选择的引物中到底哪些引物会有较好的扩增效果
PRIMER PREMIER 将根据引物二级结构的稳定性自动给引物评分并按评分排序 如果引物
二级结构较稳定
成二级结构稳定性的热力学数据来计算
其评分就较低 反之 二级结构较不稳定 评分就较高 评分是根据引物形
这些数据在评分中占的权重系数是根据经验确定的
这些系数可以在Preferences窗口修改
引物对评分
Rating
Rating = Average of sense and anti-sense primer rating -
primers
公式
Tm difference between
1.7 - G Cross Dimer 1.3
评分 正反引物平均评分 Tm差异 1.7 – 交叉二聚体 G 1.3
引物对评分是根据正反引物的平均评分 Tm差异和交叉二聚体自由能 G计算的
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附录 B 多义碱基表
以下是软件可以识别的DNA中多义碱基的代码及含义
代码 含义
B
D
H 除了G
I
K
M
N
R
SC或G
V 除了T/U
W
Y
除了A
除了C
次黄嘌呤
G或T/U
A或C
C G T/U
A
A或G
A或T
C或T/U
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附录 C 氨基酸缩写代码
以下是氨基酸的单字母记号和三字母记号
单字母记号 三字母记号 英文名称 中文名称
AAlaAlanine
C Cys Cysteine
D Asp Aspartic acid
E Glu Glutamic acid
F Phe Phenylanaline
G Gly Glycine
H His Histidine
I Ile Isoleucine
KLysLycine
LLeuLeucine
M Met Methionine
N Asn Asparagine
P Pro Proline
Q Gln Glutamine
R Arg Arginine
SSerSerine
TThrThreonine
VValValine
W Trp Tryptophan
YTyrTyrosine
丙氨酸
半胱氨酸
天冬氨酸
谷氨酸
苯丙氨酸
甘氨酸
组氨酸
异亮氨酸
赖氨酸
亮氨酸
甲硫氨酸
天冬酰胺
脯氨酸
谷氨酰胺
精氨酸
丝氨酸
苏氨酸
缬氨酸
色氨酸
酪氨酸
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附录 D 软件上限
引物长度
序列长度
最大限制性内切酶识别位点长度
最大切点显示数量
最大引物对搜索数量
70nt
50 kb
19
50
1000
35
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附录 E 参考文献
1. Lathe, R. 1986 "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence
data
theoretical and practical considerations", J. Mol. Biol. 183, 1-12
2. Breslauer, K.J., Frank, R., Blocker, H., and Markey, L. A.
stability from the base sequence", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3746-3750
3. Groebe, D.R., and Uhlenbeck, O. C.
stability", Nucleic Acids Res. 16, 11725-11735
4. Jung, V., Pestka, S. B., and Pestka, S.
containing terminal restriction endonuclease recognition sites", Nucleic Acids Res. 18,
6156
5. Kwok, S., Kellogg, D. E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C., and Shinsky,
J. J.
human immunodeficiency virus type I model studies", Nucleic Acids Res. 18, 999-1005
6. Holton, T. A., and Graham, M. W.
cloning of PCR products using ddT-tailed vectors" Nucleic Acids Res. 19, 1156
7. Freier, S.M., Kierzek, R., Jaeger, J.A., Sugimoto, N., Caruthers, M.H., Neilson T., and
Turner, D.H.
stability", Proc. Natl. Acad.Sci. USA 83, 9373-9377.
8. C.W. Dieffenbach, T.M.J. Lowe, and G.S. Dveksler
Primer Design", PCR Methods and Applications.
1990 "Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction
1986 "Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex
1988 "Characterization of RNA hairpin loop
1990 "Efficient cloning of PCR generated DNA
1991 " A simple and efficient method for direct
1986 "Predicting DNA duplex
1993 "GeneralConcepts for PCR
9. Shirley Kwok, Sheng-Yung Chang, John J. Sninsky, and Alice Wong
the Design and Use of Mismatched and Degenerate Primers", PCR Methods and
Applications.
10. Kenneth H. Roux
Applications.
11. Rychlik, W., Spencer, W.J., Rhoads, R.E. 1990 "Optimization of the annealing
temperature for DNA amplification in vitro", Nucleic Acids Research 18, 6409-6412.
12. Wetmur, J.G.
Hybridization", Criti. Rev. in Biochem. And Mol. Biol. 26, 227-259.
13. Vinay K. Singh, A.K. Mangalam, S. Dwivedi and S. Naik 1998 "Primer Premier
Program for Design of Degenerate Primers from a Protein Sequence", BioTechniques 24,
318-319.
1995 "Optimization and Troubleshooting in PCR", PCR Methods and
1991 "DNA Probes Applications of the Principles of Nucleic Acid
1994 "A Guide to
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附录 F 系统要求
对于Windows操作系统 Windows 98/NT 4/2000
最低配置 推荐配置
处理器
内存
对于Power Macintosh操作系统 7.0 或更新
处理器
内存
Pentium 100 MHz Pentium 166 MHz
32 MB 64 MB
最低配置 推荐配置
Power PC PC G3
56 MB 64 MB
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服务与技术支持
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译者后记
Primer Premier是一个不错的引物设计软件 据我所知 使用这个软件的研究工作者为数
不少
见到其说明书的详尽翻译
曾使用的技巧
涉及大量生物学和热力学专业术语
于大家查对
外
说明有些不同
说明代替
出修正版本
广
国外专业软件
也许其他高手的忽略 也许是软件的使用本就容易上手 而无需仔细研究 至今我没有
这使得我有机会为大家作上一点贡献 来回报多年共享的资源
这篇说明书本身也是比较详尽 我自认为对该软件已经很熟悉 仍通过翻译发现了某些未
而且说明书中关于引物选择等理论阐述相信也会有所帮助 同样因此 翻译中
翻译不当在所难免 所以我将大部分术语原英文附后 便
菜单选项 窗口名称为了与软件使用对应 一般采用了英文原文
软件的版本不同 其界面和操作菜单可能也有少许差异 我也在说明书中尽量注明了 另
为了清晰起见 本中文说明书中的软件插图均是重新截图 同样因为版本问题 与原英文
如蛋白质翻译截图 为编辑方便 原说明中的按钮截图都省略了 而以文字
术语索引也去掉了 请大家见谅
翻译中留下我的电子邮箱 主要目的是希望大家对于翻译的错误进行指正 如有必要会推
对于软件使用的问题只怕难以一一解答
最后感谢生物软件网 www.bio-soft.net 和谈杰站长多年来对生化专业软件的介绍和推
感谢生物软件网支持和鼓励软件说明的翻译汉化 让更多人能在研究中方便的应用优秀的
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Wenkelly
[email protected]
2003.08.19
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