Protein G Agarose
产品编号 产品名称 包装
P2009 Protein G Agarose 2ml
产品简介：
¾ 本Protein G Agarose为进口分装，主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗体的纯
化。
¾ Protein G Agarose适合于免疫沉淀mouse IgG
以及human IgG
¾ Protein G共价交联到4% agarose beads上，2ml Protein G Agarose中共含有约2mg重组的Protein G。2 ml Protein G Agarose共
可以结合约11mg human IgG。
¾ Protein G Agarose配制在TBS溶液中，含0.05%叠氮钠，2ml中共含有0.5ml Agarose beads。
¾ 本Protein G Agarose如果用于常规的免疫沉淀，可以免疫沉淀100次。
, IgG2, IgG3和IgG4。
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包装清单：
产品编号 产品名称 包装
P2009 Protein G Agarose 1ml/管，共2管
— 说明书 1份
，IgG2a, IgG2b, IgG3, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit and goat polyclonal Abs,
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保存条件：
4℃保存，一年有效。
注意事项：
¾ 请勿冷冻保存本产品。
¾ Protein G Agarose使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。
¾ 从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。
¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：
A. 蛋白样品的准备：
A1. 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液
裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及 IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、
P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。
A2. 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
A3. 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注： 详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进
行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后
的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
B. 去除非特异性结合(可选做)：
B1. 取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普
通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
B2. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注： 所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如
无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein G Agarose
的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
C. 免疫沉淀：
C1. 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
C2. 再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分
重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。)
C3. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G
Agarose。
C4. 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除
上清的要求同上面的步骤C3。
C5. 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex 重悬沉淀，瞬时高速离心
把样品离心至管底。
C6. 100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀：
参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用
冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。
3. 抗体纯化：
A. 准备工作：
A1. 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
A2. 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
A3. 选择适当的纯化柱，用适当量的Protein G Agarose装填纯化柱。
A4. 用10-20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱，流速可以用恒流泵控制为1ml/min。如无恒流泵，也可以完全依靠
重力洗涤并平衡纯化柱。
B. 抗体纯化：
B1. 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。
B2. 待纯化的抗体过柱后，用10-20倍柱体积的TBS洗涤，以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以
通过测定280nm的吸光度进行确定。
B3. 洗涤完后，用
10ml 50mM glycine， pH2.7作为洗脱液，洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein G的结合能力很
强，在pH2.7时洗脱效果不太理想，可以使用50mM glycine， pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体，根据
蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
C. 纯化柱的再生：
C1. 用10-20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱，使纯化柱达到中性的pH。
C2. 用含0.02%叠氮钠的TBS来保存再生的纯化柱。
使用本产品的文献：
1. Guo M, Huang T, Cui Y, Pan B, Shen A, Sun Y, Yi Y, Wang Y, Xiao G, Sun G.
PrPC interacts with tetraspanin-7 through bovine PrP154-182 containing alpha-helix 1.
Biochem Biophys Res Commun. 2008 Jan 4;365(1) :154-7.
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