promega G7630, G7631 User Manual

®

x

NGF E

max

免疫测试系统

原英文技术手册号码：TB226

本手册是产品 G7630 和 G7631 的使用说明。

所有技术文件均可在www.promega.com

请访问该网站以确定您所使用的是该技术公告的最新版本。

I. 描述………………………………………..………………………………………..…

II. 产品组分……………………………..………………………………………………..
III. 注意事项………………...…………………………………………………………….
IV. 样品制备…………………………………………………………………..…………..

V. NGF 定量步骤….……………………………………………………………………

A. 平板包被…………………………………………………………………………
B. 制备 1×封闭和样品液………………………………………………….………
C. 封闭平板………………………………………………………………………...
D. 制备 NGF 标准曲线………………………………………………………………

E. 加样……………………………………………………………………………...
F. 加入抗 NGF mAb………………………………………………………………..
G. 加入偶连 HRP 的抗大鼠 IgG…………………………………………………..
H. 生色反应………………………………………………………………………….
I. 标准曲线………………………………………………………………………….

VI. 疑难解答……………………………………………………………………………..
VII. 参考文献…………………………………………………………………………….

VIII. 附录………………………………………………………………………………..

A. NGF E
B. 缓冲液和溶液的组分……………………………………………………………

I. 描述

NGF(神经生长因子) E
地测定 NGF 的含量。在这种方法中，平底 96 孔板包被上抗-NGF 的多克隆抗体（pAb）,
这些多克隆抗体可结合溶液中的 NGF，被捕获的 NGF 再与特异的单克隆抗体（mAb）
结合。经过清洗，用偶联上辣根过氧化酶（HRP）的种属特异抗体作为第三级反应物， 来
测定特异结合的单克隆抗体的量。将未结合的偶联物经过清洗去掉后，再与生色底物一
同温育，检测颜色的改变。待测溶液中 NGF 的含量与氧化还原反应中产生的颜色成比例。
采用这个测试系统，对组织培养上清液或组织提取物中 NGF 的定量范围是 7.8-500

pg/ml。

®

免疫测试系统的质量特点…………………..……………………

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® 免疫测试系统采用抗体夹心法（1）（图 1），灵敏、特异

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请废除以往版本。

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注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TB226。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTB226

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用抗 NGF pAb
抗体包被培养
孔

用 1×封闭和
样品液封闭非
特异结合

配制包被抗体（每个 96 孔板）：2µl 抗 NGF pAb 抗
体+12.5 ml 碳酸包被液（pH 9.7），混合，每孔加
100µl。盖上盖子，4℃孵育过液。清洗一次。

配制 1×封闭和样品液（每个 96 孔板）： 34.4ml
去离子水+8.6ml 5×封闭和样品液。每个孔加入
200µl。不振荡，在室温孵育 1 小时。清洗 1 次。

固定的抗-NGF

pAb 抗体和
NGF 样品一同

孵育

与抗 NGF
mAb 一同孵育

制备标准曲线。用 NGF 1×封闭和样品液按 1：2，

000 比例稀释 NGF 标准品。向 A 行的第 11 、12 列
2 个孔加入 200µl。作 6 次 1：2 的倍比稀释。将待

测样品做类似稀释，每孔应含 100µl 样品。在室温
振荡孵育 6 小时。清洗 5 次。

配制二抗溶液（每个 96 孔板）：2.5µl 抗-NGF
mAb+10 ml 的 1×封闭和样品液。每孔加 100µl。
不振荡，4℃孵育过液。清洗 5 次。

与 HRP 标记的
抗大鼠 IgG 抗
体一同孵育

配制 HRP 标记的抗大鼠 IgG 抗体溶液（每个 96 孔
板）：取 100µl HRP 标记的抗大鼠 IgG 抗体与 9.9 ml
的 1×封闭和样品液混合。每孔加 100µl。在室温振
荡孵育 2.5 小时。清洗 5 次。孵育过程中，将 TMB
溶液从冰箱中取出，使其温度恢复到室温。

加入 TMB 单溶

图 1. NGF E

液，然后加入终
止液，在酶标仪
上比色。

max

® 免疫测试系统的操作步骤图示

每个板：每孔加入 100µl 平衡到室温的 TMB 单溶液，
室温振荡孵育 10 分钟。

每孔加入 100µl 的 1N HCl 终止反应。在 30 分钟内
测定 A

450

。

。

若需详细操作手册或第一次使用这一系统，请仔细阅读章节Ⅲ到Ⅵ。

®

NGF E

免疫测试系统有如下的优势：

max

• 特异性：特异检测 NGF， 与浓度在 10ng/ml 的其它神经营养因子的交叉反应一般小
于 3%。

• 灵敏度：可检测的 NGF 的最小量是 15.6pg/ml。

• 灵活：提供可供测试 2 个或 5 个 96 孔 ELISA 平板的包装，可按需要改变配置。

• 高值：提供优化的试剂和实验方案。

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TB226。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTB226

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II．产品组成

NGF E

®

免疫测试系统提供两种规格，可供测试 2 个或 5 个 96 孔板。两种包装

max

含有的试剂相同，只是产品 G7631 中的各种组份含量较多。

产品 规格 目录号

NGF E

®

免疫测试系统 2×96 孔板

max

G7630

每个系统含有的试剂可测定 160 个样品（不包括平板）以及标准曲线，包括：

5µl

22ml

20µl

10µg

200µl

25ml

Anti-NGFpAb (抗 NGFpAb)
Block and Sample 5×Buffer（5×封闭和样品液）
NGF Standard（NGF 标准）
Anti-NGF mAb（抗 NGF mAb）
Anti-Rat IgG, HRP Conjugate（HRP 标记的抗大鼠 IgG）
TMB One Solution（TMB 单溶液）

1 Protocol

产品 规格 目录号

®

NGF E

免疫测试系统 5×96 孔板

max

G7631

每个系统含有的试剂可测定 400 个样品（不包括平板）以及标准曲线，包括：

10µl

54ml

50µl

20µg

500µl

2×25ml

Anti-NGFpAb (抗 NGFpAb)
Block and Sample 5×Buffer（5×封闭和样品液）
NGF Standard（NGF 标准）
Anti-NGF mAb（抗 NGF mAb）
Anti-Rat IgG, HRP Conjugate（HRP 标记的抗大鼠 IgG）
TMB One Solution（TMB 单溶液）

1 Protocol

贮存条件：将整个系统的原包装避光保存在-20℃，从购买之日起 6 个月内产品稳定。一
旦解冻，需保存在 4℃，系统在 3 个月内稳定。每个组分使用后应立即放到 4℃。不要重
新冻存试剂。稀释后的试剂应当天使用。不要向稀释后的溶液内添加任何一种防腐剂，防
腐剂可能干扰测试。

III．注意事项

我们用以下的实验方案对 NGF E

®

免疫测试系统作了测定。平板需包被过夜。次

max

日，平板需封闭 1 小时，样品孵育 6 小时。与抗 NGF mAb 的反应也需过夜。当将 NGF
标准品和待测样品转移到平板上时，注意不要破坏或刮磨孔的表面，否则会导致 pAb 抗
体的脱落，使信号明显减弱。如果不熟悉这项技术，在一个训练培养板上练习加样步骤。

测试方法的局限

z 只适用于研究，不能用于珍断。
z 吸收值超过标准曲线的范围为无效。
z 为获得稳定结果，需用 1×封闭和样品液稀释样品。

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TB226。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTB226

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避免使用含有大
量 IgG 的样品，
如血清、血浆和脾
脏。

不要用酸处理

NGF 标准品

HCl 和 NaOH 具

有腐蚀性，切勿接
触皮肤和眼睛。

IV．样品制备

NGF E
系统使用了标记的抗大鼠 IgG 抗体，可以与样品中的小鼠 IgG 或人 IgG 发生交叉反应，

®

免疫测试系统可用来定量组织培养上清液或组织提取物中的 NGF。该

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使得吸收值读数升高。避免使用含有大量 IgG 的样品，如血清、血浆和脾脏。使用前
将实验样品冰冻保存，不要反复冻融。在进行测试前，离心除去样品中的颗粒。

用几种种属的不同组织提取物进行实验，结果表明，酸化处理后再用碱中和，会
增加可检测到的 NGF 的含量（2—4）。酸化处理会使 NGF 从 7S 态水解为 2.5S 态，
或者导致可溶性受体释放 NGF，也可能两种情况都有。总之，可在体外对样品进行酸
化处理， 这能增加可检测到的 NGF 的含量。酸化处理后 NGF 检测量的提高与种属和
组织特异性有关，然而在某些情况下，酸处理可能会导致 NGF 检测量的下降。因此，
对每一特定的种属和组织而言，进行酸处理步骤的测定以确定预处理的效果是很重要
的。

注意：这一测试方法是用来测定游离的 NGF。如要测定样品中游离的成熟 NGF
蛋白，不要进行酸处理，直接按章节 V. A 的 ELISA 手册作实验。若要检测总的 NGF，
先按下面的步骤进行酸处理及中和，然后再按 ELISA 步骤进行 NGF 测定。不要将 NGF
标准品进行酸处理。

酸处理步骤

实验中将样品按 1：5 比例用 Dulbecco 氏 PBS（DPBS）稀释酸化到大约 pH2.6，
然后中和到大约 pH7.6。依据样品中载体蛋白的量，也许还需要或不再需要用 1×封闭
和样品液作进一步的稀释，以减少 NGF 的损失。

对于蛋白含量低的样品，建议直接酸处理到 pH2.0-3.0，15-20 分钟。随后用 NaOH
中和，如需进一步的稀释，应使用 1×封闭和样品液，再将样品加到测试平板上。

对于所有实验样品，用 pH 试纸确认 pH 低于 3.0。如用动物血清，依据不同的
种属，需要不同量的 1N HCl 来降低 pH。建议每 ml 未稀释的血清或血浆加入 110-125µl
的 1N 的 HCl，在加入更多的酸以前，应先检测 pH 值。样品可提前作酸化处理并保存
在-20℃或-70℃。

客户需准备的材料
（溶液组成见章节Ⅷ.B.）

·DPBS

·1N HCl，试剂级

·1N NaOH，试剂级

1．加入 4 倍体积的 DPBS 对样品进行稀释。
2．每 50µl 稀释的样品中加入 1µl 的 1N HCl，确认 pH 为 3.0 或低于 3.0。
3．混合，在室温孵育 15 分钟。
4．在每 50µl 稀释样品加入 1µl 的 1N NaOH 进行中和，检测 pH，使其约为 7.6。

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TB226。如遇到问题请与 Promega 公司北京
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V． NGF 定量步骤

客户需准备的材料
（溶液组成见章节Ⅷ.B.）

·96 孔（平底）ELISA 板

·碳酸包被液

·平板密封膜

·TBST 清洗液

·1N HCl

·可在 450nm 测定吸收值的微孔板酶标仪

·加样器，可准确加样的范围在 1µl-1ml

·多道加样器

·洗液瓶或自动平板清洗器

·平板振荡仪

·稀释用 50ml 或 15ml 聚丙稀管

A．平板包被
1． 在 50ml 或 15ml 聚丙稀管中，向 12.5 ml 碳酸包被液中准确加入 2μl 抗 NGF pAb

抗体，配制成足够整个 96 孔板使用的包被液。充分混合，避免产生气泡。用多道
加样器向聚苯乙稀 ELISA 板中加入包被液，每孔 100µl。

2． 用密封膜密封 ELISA 板，4℃孵育过夜。

注意：该测试使用的是按照章节 VIII.B 配制的碳酸包被液，已优化，其他缓冲液的效果
可能不佳。

B．配制 1×封闭和样品液

次日，每个 96 孔板需要大约 43 ml 的 1×封闭和样品液。配制 1×封闭和样品液
时，在 50 ml 聚丙稀管中加入 34.4ml 去离子水，用消毒的加样头吸取 8.6ml 的 5×封
闭和样品液，加入水中，注意不要污染贮液。使用前，将该溶液轻柔而充分地颠倒混合。

C．封闭平板

1． 从冰箱中取出已包被的平板，轻轻甩去培养孔中的液体，倒置在纸巾上拍打三次，

以去除残留的液体。使用自动平板清洗器，洗液瓶或多道加样器，用 TBST 清洗液
充分清洗培养孔。如是手工清洗，在每个孔中加满 TBST 清洗液，然后向水槽中轻
轻甩去培养孔中的液体，倒置在纸巾上拍打三次。用多道加样器在每个孔中加入

200µl 的 1×封闭和样品液。抗体结合到平板上后，不要接触或刮磨培养孔的表面。

2． 不要振荡，在室温孵育 1 小时。

注意：此分析试
剂已经过上列制
造商 Nunc
MaxiSorp™( 产
品目录号：

439454) 和
DYNEX
Immulon

®

-4( 产

品目录号：
011-010-3855) 的
酶标板的测试而
没有显著性差
异。为了得到各
孔间最好的精确
度，我们推荐使
用高质量的、著
名品牌的聚苯乙
烯酶标板。

提示：未稀释的

Anti-NGF PAb 从
4℃取出后，应置

于冰上保存

注意：我们强力
推荐使用自动洗
板机以保持结果
的一致。

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D．制备 NGF 标准曲线

系统提供的 NGF 标准品产生的线性标准范围在 7.8-500pg/ml。只可使用落在该线

性范围内的值来推算待测样品中的 NGF 浓度。提供的 NGF 标准品的浓度是 1µg/ml，

不要在任何两个
步骤间让培养孔
完全干燥。

提示：未稀释的
NGF 标准品从 4
℃取出后，应置于
冰上保存。

用 1×封闭和样品液按比 1：2000 的比例，准确稀释 NGF 标准品，使其浓度达到
500pg/ml。例如，将 10µl NGF 标准品加入到 390µl 1×封闭和样品液（1：40 稀释），
然后将 10µl 的上述稀释液加入到 490µl 的 1×封闭和样品液中，进行 1：2000 稀释。

1． 封闭平板完成后，向水槽中轻轻甩去培养孔中的液体。倒置在纸巾上拍打三次以除

去残留液体，按章节 V. C 步骤 1 所述，用 TBST 清洗液清洗一次。用 2 列孔（16
个孔）来制备标准曲线。在测试平板中，配制 NGF 标准品时，在用来制备标准曲
线的 2 列孔的行 B 到行 H 孔中加入 100µl/孔 1×封闭和样品液（图 2）。

2．在用来制备标准曲线的每列培养孔的第 1 个孔中，加入稀释的 200µl NGF 标准品

（500pg/ml）。

3．在用来制备标准曲线的两列孔的后续孔中，接着按 1：2 的比例将 NGF 标准品作

系列稀释（100µl/孔）。在制备标准曲线的两列孔的最后一对孔中，不要加入 NGF。
平板中的 NGF 标准品的终浓度（2 个复孔）在 0-500 pg/ml 范围内（图 2）。

注意：系列稀释的
样品有可能不呈
线性。应使用接近
标准曲线中段的
吸收值所对应的
样品稀释度进行
检测。

注意：尽快加样以
减少蒸发。

37℃孵育时不要
叠放酶标板。

图 2. 进行标准曲线和测试样品的 ELISA 平板示意图

E．加样

建议首先将样品按 1：4 的比例稀释，接着在 ELISA 平板中的每一列按 1：2 作倍
比稀释。也可以先对单一浓度的样品进行筛选，然后对不在线性范围内的阳性样品作
重新测试，来确定 NGF 的准确浓度。

样品的载体溶液也会提供一些非特异的 NGF 来源（如培养基中的血清），建议测
试单独含有载体溶液的一系列阴性对照反应。

1． 在制备了 NGF 标准曲线后， 在其它培养孔中加入 100µl 样品（依据具体实验要

求已作或未作酸处理）（样品的酸处理见章节 IV）。注意：尽快加样以减少蒸发。

2． 用密封膜密封培养孔，在室温振荡孵育 6 小时（500±100rpm）。

注意：使用振荡器可获得最好的结果。也可将 96 孔板置于 37℃孵育，不振荡，但
可能使测试敏感性略微降低。

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3． 按章节 V. C 步骤 1 用 TBST 清洗液将所有培养孔清洗 5 次。

F．加入抗 NGF mAb

1． 在 50ml 或 15ml 聚丙稀管中，向 10 ml 的 1×封闭和样品液中加入 2.5µl 的抗 NGF

mAb（1：4，000 的比例稀释），可配制成足够用于整个 96 孔板的溶液。充分混合，

但不要产生气泡。用多道加样器向每个孔中加入 100µl 稀释的抗 NGF mAb，注意
不要接触或刮磨孔的底面和侧壁。

2．用密封膜密封培养孔，不要振荡，4℃孵育过液。
3．次日，按章节 V. C 步骤 1 用 TBST 清洗液将所有培养孔清洗 5 遍。

G．加入 HRP 标记的抗大鼠 IgG

1． 在 15 ml 聚丙稀管中， 将 8ml 去离子水和 2ml 5×封闭和样品液混合，配制成 10ml

新鲜的 1×封闭和样品液。同样，不要污染贮液。使用前颠倒数次，温和而充分地
混合。

2． 在 50ml 或 15ml 聚丙稀管中，向 9.9 ml 的 1×封闭和样品液中准确地加入 100µl

HRP 标记的抗大鼠 IgG 贮液（1：100 的比例稀释），配制成足够用于 96 孔板的溶

液。充分混合，避免产生气泡。用多道加样器向每个孔中加入 100µl 稀释的标记抗
体，注意不要接触或刮磨孔的底面和侧壁。

3．室温振荡（500±100rpm）、孵育 2.5 小时，。

注意：若使用平板振荡器，最后得到的实验结果最佳。 也可以在孵育时不振荡，

但灵敏度会有所下降。

4. 按章节 V. C 步骤 1 用 TBST 清洗液将所有培养孔清洗 5 遍。

H．生色反应

1． 用多道加样器向每个孔中加入 100µl 恢复至室温的 TMB 单溶液。

2．在室温振荡、孵育 10 分钟。

3. 按照步骤 1 加入 TMB 单溶液的同样顺序，加入 100µl 的 1N HCl 来终止反应。酸
化后，蓝色变为黄色，注意不要产生气泡。

4．在终止反应后 30 分钟内，在平板酶标仪的 450nm 处记录吸收值。

提示：抗-NGF

mAb 和 HRP 标

记的抗大鼠 lgG,
从 4℃取出后，
应将其置于冰上
保存。

提示：在孵育期
间，将 TMB 单溶
液恢复至室温。

警告：小心避免
让 TMB 单溶液
及 IN HCl 接触皮
肤或眼睛。

注意：若要得到
准确的测量结
果，酶标板的外
底必须干净。如
果需要可用 70%
乙醇擦拭酶标板
的外底。

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I． 标准曲线

图 3. 使用 NGF E

插入图是放大的 0-31.252pg/ml 曲线段

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免疫测试系统制备的 NGF 标准曲线

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VI． 疑难解答

问题 可能的原因 建议
样品的吸收值高

样品太浓
于标准曲线的范
围

样品的吸收值低

样品太稀 用浓度更高的样品进行测试
于标准曲线的范
围

所有样品的吸收
值均高

在溶液和培养

基中含有 NGF

显色反应时间

太长

使用的是含有

大量 IgG 的小

鼠、人及大鼠的

样品

显色反应太慢
值均低

进一步稀释样品
测试每个样品的多种稀释度，以保证至少有一

个样品稀释度处于标准曲线的有效范围内。

在溶液和培养基中可能含有 NGF。设置只加载
体溶液，不加样品的阴性对照实验。

吸收值超过了平板读数仪的动态范围，减少显
色反应的时间，或使用动态范围更宽的平板酶
标仪。

避免使用含有大量 IgG 的样品，如血清、血浆
和脾脏。

增加显色反应的时间 所有样品的吸收
重新检查每一反应组分的稀释度

如遇到这里未提
及的疑难问题，
请与美国普洛麦
格公司北京办事
处联系，或查询
我们的

www.promega.co
m.

E-mail:

techserv@promeg
a.com

网站

平行样品之间存
在差异

进行测试时存

在技术问题

保证所有的培养孔都被充分清洗。
使平板在室温中升温 10-15 分钟，再开始封闭

步骤。
按照加入 TMB 单溶液的加样顺序加入终止液
在加每种试剂前，更换加样头。
增加平行样的个数
校准加样器

NGF 标准活力低 贮存不当 如果不稀释，标准在-20℃可稳定保存 6 个月，

在 4℃可稳定保存 3 个月。

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VII．参考文献

1. Hornbeck, P. (1994) In: Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Coico, R ed.,
John Wiley & Sons, Inc, Unit2.1.

2. Zettler, C. et al. (1996) Detection of increased tissue concentrations of nerve

growth factor with an improved extraction procedure. J. Neurosci. Res 46,
581-594.

3. Acid Treatment of NGF Samples (1996) Neural Notes II (3), 23.

4. Okragly, A. J. and Haak-Frendscho, M. (1997) An acid-treatment method for the

enhanced detection of GDNF in biological samples, Exp. Neurol. 145, 592-596.

VIII 附录

A. NGF E

NGF E

NGF E

®

免疫测试系统的质量特点

max

®

免疫测试系统的交叉反应

max

®

免疫测试系统与结构相似的生长因子，如重组脑源性神经营养因子

max

（rhBDNF）, 神经营养因子-3(rhNT-3), 神经营养因子-4(rhNT-4)，在浓度高达 10ng/ml
时有很低的交叉反应，如下表所示。

神经营养因子 实际浓度（ng/ml） %交叉反应

BDNF 10 0.078
NT-3 10

NT-4 10

0.078

0.078

为了评估该测试系统的特异性， 用 10ng/ml 的 rhBDNF（目录号 G1491）， NT-3（目
录号 G1501）和 rhNT-4（目录号 G1511）按章节 III-V 所描述的步骤，测试其结合力。
结果表示的是 3 次重复测试的平均值。

不同批次测试之间的比较
将经过酸处理的待测样品用 1×封闭和样品液稀释， 由同一个操作者将每种样品重复
测定 8 次。

NGF

样品数
平均值（pg/ml）
标准差（pg/ml）
变异系数

样品1 样品2

8 8

194 402

8 17

4.1 4.2

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B. 缓冲液和溶液的组分

1N HCl

将 82.7ml 的浓 HCl 加入到 917.3ml 的去
离子水中。

碳酸盐包被缓冲液

0.025M 碳酸氢钠

0.025M 碳酸钠

用 1N HCl 或 1N NaOH 调节 pH 到 9.7

裂解液

137mM NaCl

20mM Tris HCl (pH8.0)

1% NP40

10%

甘油

1mM PMSF

10µg/ml

1µg/ml

0.5mM

aprotinin（抑酶肽）
leupeptin（亮抑酶肽）

钒酸钠

DPBS（每升）

0.2g KCl

8.0g NaCl

0.2g KH

1.15g Na
133mg CaCl
100mg MgCl

2PO4

HPO4

2

.2H2O

2

.6H2O

2

将温度是室温的去离子水加入到 KCl，
NaCl，KH

和，Na2HPO4至终体积为

2PO4

1 升，如有必要，用 1N HCl 或 1N NaOH

调节 pH 到 7.35，然后加入 MgCl2.6H2O，
充分混合， 然后加入 CaCl

.2H2O 充分

2

混合。

TBST 清洗液

20mM Tris-HCl (pH7.6)

150mM NaCl

0.05%(v/v) Tween® 20

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TB226。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTB226

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