PowerPlex® Matrix
Standards, 3100
所有的技术文献均可从公司网站www.promega.com得到
请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本
I. 介绍 1
II. 产品组分 2
III. 在 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪上产生 PowerPlex®光谱校正文件 2
A 光谱运行模式
B 光谱参数
C Matrix 样品制备 3
D 仪器准备 3
E 光谱校正运行 4
F 光谱校正结果 4
IV. 样品 DNA 扩增
V. 用 ABI PRISM
A 样品制备 5
B 仪器准备 5
C 样品运行 6
D 数据分析 6
E PowerTyperTM Macros 7
VI 疑难解答
VII. 相关产品
I.介绍
产生合适的光谱校正文件
的关键
试剂盒含有用 4 种不同荧光素标记的片段
, 7 -双甲氧基荧光素 JOE 标记的 160bp 的片段 一个管含有用荧光素 FL
标记的 250bp 的片段 一个管含有用羧基一四甲基罗丹明 TMR 标记的 300bp 的片
一个管含有用羧基-X-罗丹明 CXR 标记的 350bp 的片段
段
这些 Matrix 片段混合后
的光谱校正 生成的光谱校正文件可用于 PCR 样品检测中计算互相重叠的 4 种不同颜
色的光谱
设计
遗传分析仪的操作手册可从制造商获得
术手册 TMD006
统技术手册 TMD009
统技术手册 TMD012
www.promega.com
注意 本中文操作手册仅供实验参考 在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TBD016 如遇到问题请与 Promega 公司北
京办事处联系 TEL: 010-68498287 E-mail: techserv@promega.com.cn 技术手册号码 CTBD016
也能用于任一个 GenePrint® 荧光 STR 系统
每一台 ABI PRISM
若需获取 Promega 其他 STR 荧光系统的信息
®
3100 遗传分析仪检测扩增样品
用于 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪的 PowerPlex® Matrix Standards 3100
PowerPlex® Matrix Standards 3100 专为 PowerPlex® 16 和 1.2 系统所
®
3100 遗传分析仪均需独立产生一个 Matrix ABI PRISM® 3100
PowerPlex® 1.1 荧光 STR 系统技术手册 TMD008 PowerPlex® 1.2 系
PowerPlex® 2.1 STR 系统技术手册 TMD011 PowerPlex® 16 系
这些技术手册和进一步的产品信息可以登陆 Promega 网站
或直接从 Promega 索取
原英文技术手册号码
本说明书用于产品 DG3380
是用 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪评估多色荧光系统
一个管含有用 6-羧基-4 5 -双氯-2
用于在 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪上完成 dye set Z
参考 GenePrint® 荧光 STR 系统技
第 1 页 共 1页
TBD016
2
2
4
4
8
8
II 产品组分
产品 目录号
®
PowerPlex
Matrix Standards 3100 DG3380
包括
保存条件
建议这些组分和扩增后试剂一同保存并使用不同的加样器和管架等
l
20
20
l
l
20
20
l
1.25ml
1
所有组分保存在-20 Matrix 标准中的片段是光敏的 必须保存在黑暗中
在 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪上产生 PowerPlex®光谱校正文件
III
用户提供的材料
加热块
水浴箱或热循环仪
冰
用于 3100 的 capillary array, 36cm
用于 3100 的 Performance Optimized Polymer 4
含 EDTA 的 10
用于 3100 的 sample tubes 和 septa
注意
件
A
防污染的加样头
为了使建立的光谱校正系统成功运行 需要改进两个文件 第一个为运行模式文
第二个为参数文件
光谱运行模式
1. 打开"ABI PRISM
2. 打 开 "tools" 中 的 "module editor". 在 "calibration" 菜 单 下
"Spect36_POP4DefaultModule"模式
3. 改变"Spect36_POP4DefaultModule"模式中的"Run time"从 800 秒改为 2000 秒
4. 在新文件名下保存改变后的模式
PowerPlex"
校正的运行模式
光谱参数
B
1. 光谱参数文件的打开路径为
D:\appliedbio\SupportFiles\Dafa Collection Support Files\Calibration
Data\Spectral Calibration\ParamFiles
2. 选择"mtxStd{Genescan_SetD}.Par"
文件
3. 改变"Condition Bounds" 范围到[6.0, 9.0]
4. 用一个新文件名存贮参数文件
此为所有使用 PowerPlex® Matrix Standards 3100 进行光谱校正运行的参数
文件
JOE160 Matrix Standard
FL250 Matrix Standard
TMR 330 Matrix Standard
CXR 350 Matrix Standard
Nuclease-free water
技术手册
POP-4
遗传分析仪缓冲液
®
3100 collection"软件
如使用新文件名"Spect36_POP4
此为所有使用 PowerPlex® Matrix Standards 3100 进行光谱
这将打开 Microsoft® Notepad 中的".par"
如使用 mtxStd{Genescan_SetZPowerPlex}
选择
注意 本中文操作手册仅供实验参考 在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TBD016 如遇到问题请与 Promega 公司北
京办事处联系 TEL: 010-68498287 E-mail: techserv@promega.com.cn 技术手册号码 CTBD016
第 2 页 共 2页
C Matrix 样品制备
注意
室所用 ABI PRISM
测试的灵敏度依仪器而变化 下列推荐的 Matrix 样品稀释度可依据不同实验
®
3100 遗传分析仪的灵敏度而进行优化
1. 高浓度片段的初始稀释
水按 1:10 稀释每一个片段
在四种荧光标记的 DNA 片段混合前 先用无核酸酶的
涡旋振荡混匀
JOE FL TMR CXR
高浓度荧光标记物 2
l 2 l 2 l 2 l
无核酸酶水 18 l 18 l 18 l 18 l
2. 片段混合
光标记的 DNA 片段
用 1:10 稀释的各荧光标记的 DNA 片段 用步骤 1 中初始稀释的荧
按下列方式混合
JOE 标准
FL 标准
TMR 标准
CXR 标准
无核酸酶水
480
5
l
l
5
5
l
l
5
l
®
3. 在 ABI PRISM
检测
加入 25
4. 95
变性样品 3 分钟后迅速放置在冰上冷冻 3 分钟 将准备好的样品盘放至 ABI
PRISM
3100 遗传分析仪上 16 个毛细管同时进行 16 个样品孔的 Matrix
96 孔板的 A1 到 H2 孔 在 96 孔板的 16 个孔 A1 到 H2 的每一个孔中
l 步骤 2 中制备的各片段混合液
®
3100 遗传分析仪上进行 Matrix 的生成
D 仪器准备
1 按照 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪用户操作手册来进行泵清洗 安装毛细管列
进行空间校正 以及向注射器中添加聚合物
2
打开 ABI PRISM® "3100 collection"软件
打 开 "new plate record" 命名放入仪器中的平板并选择"Spectral
3
Calibration"
点击"Finish"
4
完成加样孔的平板记录表 在"Sample Name"栏输入适当的信息
在"dye set"栏 从下拉菜单中选择"Z"
5
6
在"spectral run module"栏 从下拉菜单中选择"Spect36_POP4PowerPlex" 此
为步骤 III.A.中设置的模式
7
在 "spectral parameters" 栏 从下拉菜单中选择"mtxStd{Genescan_SetZ
PowerPlex}"
光谱生成反应板的设定如下显示
Well
A1 Matrix Z
点击"plate type"选择平板大小 96-孔板或 384-孔板 然后
此为步骤 III.B.中设置的文件
Sample
Name
Dye
Set
Comment
Spectral Run
Module
Spect36_
POP4PowerPlex
Spectral
Parameters
MtxStd{Genescan
_SetZPowerPlex}
8 点击"OK" 这个新的平板记录就会出现在收集软件的平板设置页的待定平板记录
表中
在高浓度片段的
初始稀释及所稀
释的片段混合时
不要用福尔马林
稀释荧光标记物
样品变性的时间
不要超过 3 分钟
以防蒸发
注意 本中文操作手册仅供实验参考 在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TBD016 如遇到问题请与 Promega 公司北
京办事处联系 TEL: 010-68498287 E-mail: techserv@promega.com.cn 技术手册号码 CTBD016
第 3 页 共 3页
福尔马林一
警告
种有刺激性的和
致崎的试剂
避免
吸入及与皮肤接
在您使用此试
触
剂时请阅读警示
标记并作必要的
防范措施
在使用
福尔马林工作时
通常需要戴双层
手套及防护眼镜
E 光谱校正运行
1 在待定平板记录表中 点击设定的平板记录名
一旦平板记录标出 点击平板图 此平板图与自动进样器中含有光谱校正样品
2
的平板相对应
一旦平板记录与平板连接 平板图会从黄色变为绿色 平板记录就从待定平板
3
记录表变为连接平板记录表
4
点击工具栏中绿色的" "来起始光谱校正运行
此时仪器运行键" "被激活
F
光谱校正结果
1 在光谱校正运行完成后 "Spectral Calibration Result"视窗打开 指示哪
些毛细管通过了校正
2
点击"OK"
浏览光谱校正数据 在收集软件的工具菜单中 选择"Display Spectral
3
Calibration"
点击"Dye Set"键 从下拉菜单选择"Dye Set Z" 然后点击"OK"
4
5
"Matrices for Dye Set Z"视窗显示每一个毛细管的光谱校正资料 用滚动条
来阅览 16 个毛细管的数据
管必须满足下列条件才能通过校正
" "表明毛细管通过校正 "X"表明毛细管未通过校正
对于 PowerPlex® Matrix Standards 3100 毛细
Q-value 必须大于 0.95
Condition number 或 C-value 必须在 6.0 到 9.0 的范围内
点击"OK"来关闭视窗
6
7
如果一个毛细管未通过校正 会从左边最临近的一个通过校正的毛细管自动生
成光谱数据
细管通过校正
释一份浓缩的 Matrix 标准
请参照章节 VI
建议 16 个毛细管中至少有 12 个应通过校正 如果少于 12 个毛
必须重新进行光谱校正 当重新光谱校正运行时 必须重新稀
并设立新的片段混合物 关于光谱校正疑难解答
IV.样品 DNA 扩增
®
PowerPlex
的 PowerPlex
DNA 样品的扩增需参照相应试剂盒的技术操作手册所规定的条件进行
GenePrint
术手册 TMD009, 及 PowerPlex
的产品信息可以登陆网站 www. promega. com 或直接从 promega 索取
Matrix Standards 3100 所产生的光谱校正文件适用于 Promega 公司
®
16 系统 PowerPlex® 1.2 系统及其它 GenePrint®荧光 STR 系统
请参照
®
Fluorescent STR System 技术手册 TMD006, PowerPlex® 1.2 系统技
®
16 System 技术手册 TMD012 这些技术手册和相关
V. 用 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪检测扩增样品
用户提供的材料
加热块 水浴箱 或热循环仪
冰
3100 毛细管列 36cm
用于 3100 的电泳胶 POP-4
含 EDTA 的 10 遗传分析仪缓冲液
用于 3100 的样品管或隔
防污染加样头
去离子甲酰胺 电导率 100 s/cm Amresco 超纯级 目录号#0606
注意
在-20
甲酸胺的质量很关键 使用电导率 100 s/cm 的甲酰胺 甲酰胺可以分装并
C 冰冻保存 多次冻融或在 4 C 长期保存会使甲酰胺降解 电导率 100
s/cm 的甲酰胺含有离子 在进样时和 DNA 竞争 这将降低样品的峰值和灵敏度 增
加进样时间不会增加信号强度
注意 本中文操作手册仅供实验参考 在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TBD016 如遇到问题请与 Promega 公司北
京办事处联系 TEL: 010-68498287 E-mail: techserv@promega.com.cn 技术手册号码 CTBD016
第 4 页 共 4页
A 准备样品
在 PowerPlex®16 系统中带有内标 600 目录 DG2611 作为四色荧光检测及扩增样品
分析的内标
Powerplex
按下面方法准备由内标及去离子甲酰胺组成的上样混合物
1
[
在每一孔中加入 10 l 甲酰胺/ 内标混合物
2
3
加入 1 l 扩增样品 或 1 l 等位基因梯度混合物
注意
要适当增加或减少
增样品需要在 Gold ST*R 1
ILS 荧光梯度 CXR 60-400 碱 基 目录号 DG6221 包含在
®
1.2 系统中 也可用于 GenePrint® Fluorescent STR 系统
1.0 l 内标 #进样数 ]+[ 9.0 l 去离子甲酰胺 #进样数 ]
由于不同仪器检测低限的差异 因此 电泳时的进样时间或扩增产物量需
如峰值太高 大于 4000rfu 在与加样混合物混合前 扩
缓冲液中稀释 这可能导致等位点间不均衡的峰高
为获得最佳结果 可在扩增反应中使用更少量的 DNA 模板 或在扩增程序中减少
扩增循环数 2-4 次
4
95 变性样品 3 分钟 然后立即放置冰上冷却 3 分钟 变性后的样品板直接装载
到 3100 遗传分析仪进行电泳
仪器准备
B
1 按照 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪用户操作手册来进行泵清洗 安装毛细管列
进行空间较正 以及向注射器中添加电泳胶 POP-4
打开 ABI PRISM® "3100 collection"软件
2
3
打开"new plate record" 命名放入仪器中的平板并选择"GeneScan" 点击"plate
type"选择平板大小
4
完成已加样孔的平板记录表 在"Sample Name"和"Color info"栏输入适当的信
对于等位基因梯度样品 在"Color info"栏中对应"dyes"栏"B","G"和"Y"
息
的位置
PowerTyper
5
在"BioLIMS Project"栏 从下拉菜单中选择"3100_Project1"
在"Dye Set"栏 从下拉菜单中选择"Z"
6
7
在"Run Module 1"栏 从下拉菜单中选择"GeneScan36_POP4DefaultModule"
若收集数据而不进行自动分析 则 在 "Analysis Module 1" 栏 中 选 择 "No
8
Selection"
设定
析模式
插入单词"Ladder" 这些信息必须输入以确保用 PowerTyperTM16 或
TM
1.2 Macro 对数据的成功分析
分析参数可在数据收集后 用 GeneScan®分析软件进行数据分析时
若需要自动分析数据 则需在"Analysis Module 1"栏中 选择适当的分
分析模式的设置指南 参照 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪用户手册
设置后的平板记录会出现如下的 GeneScan
96-孔板或 384-孔板 然后点击"Finish"
®
信息
为了调整标准峰
高
用于配制上样
混合物的内标体
积可增大或减
小
9 点击"OK" 则新的平板记录 new plate record 出现在收集软件 collection
software
中
的平板设置页的待定平板记录表(pending plate records table)
注意 本中文操作手册仅供实验参考 在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TBD016 如遇到问题请与 Promega 公司北
京办事处联系 TEL: 010-68498287 E-mail: techserv@promega.com.cn 技术手册号码 CTBD016
第 5 页 共 5页
C 样品运行
1 在待定平板记录表中 点击新设置的平板记录名
当平板记录变亮 点击平板图
2
3
一旦平板记录与平板连接 平板图会从黄色变为绿色 平板记录就从待定平板
记录表变为连接平板记录表
4
点击工具栏中的" "键起始样品运行
在收集软件内 通过观察"run" "status" "array"及"capillary views"视
5
窗
监测电泳状况
此时运行仪器键" "被激活
D
数据分析
依据随试剂盒一起提供的 Promega 技术手册中描述的方法 用 GeneScan®分析软件
进行数据分析
这些技术手册包括 GenePrint®荧光 STR 系统技术手册 TMD006
PowerPlex®1.2 系统技术手册 TMD009 PowerPlex®16 系统技术手册 TMD012 这些
技术手册的查询及进一步的产品信息
可登陆 Promega 公司网站www.promega.com
或直接从 Promega 公司索取
有关 GeneScan® 分析软件的进一步信息 参照 GeneScan® 分析软件用户指南
注意
如在 CXR 红色 峰处出现 TMR 黄色 峰 在红色峰分析参数中 需要提高峰
的临界值
于 300rfu
如 100-200rfu 这不会干扰数据分析 因为 CXR ILS 的峰值应大
理想的样品峰值应小于 2000rfu
当峰值>4000rfu 时 由于仪器饱和 如上样过载 会导致伪峰的产生 可以观
察到从一种颜色的峰到另一种颜色峰的拉升或消减现象
如果样品峰值不在仪器的线性检测范围内 stutter 峰和真实等位基因的峰值比
会增加
并且等位基因的命名变得困难 同时会引起峰值的不均衡
不同仪器对同一样品的相对荧光单位检测会有所差异 此外 仪器对不同色谱
检测的相对效率的差异也会影响峰的平衡
注意 本中文操作手册仅供实验参考 在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TBD016 如遇到问题请与 Promega 公司北
京办事处联系 TEL: 010-68498287 E-mail: techserv@promega.com.cn 技术手册号码 CTBD016
第 6 页 共 6页
E PowerTyperTM Macros
为了便于分析 PowerPlex® 16 和 PowerPlex® 1.2 系统产生的数据 我们对每一系统设
®
立了应用 ABI GenoTyper
PowerPlex
GeneScan
®
1.2 系统扩增后的样品用 ABI PRISM® 3100 遗传分析仪进行检测并用
®
分析软件进行数据分析 用 GeneScan®分析软件进行数据分析后的样品文件
可以导入到 GenoTyper
TM
PowerTyper
1.2 Macro 目录号 DG2601 进行分析 两种 PowerTyperTM Macros 可
软件进行基因型自动分析的文件 使用 PowerPlex® 16 和
®
程序内 然后用 PowerTyperTM 16 Macro 目录号 DG2850 或
免费从 Promega 公司获取或从 www.promega.com/ geneticidentity/gitech.html 下
载
TM
PowerTyper
Windows NT
必须在计算机上安装 GenoTyper®软件
前
在 Windows NT
是"PowerTyper16Macro.gta"或者"PowerTyper12Macro.gta"
括".gta"文件扩展名方可被 Windows NT
ABI PRISM
version 进行分析
些数据导入到 Macintosh
个效用使 Windows NT
Macros 可 和 Macintosh® Genotyper® version 2.0 或更高版本以及
®
Genotyper® version 3.5 或更高版本兼容 在使用 PowerTyperTM Macro
®
version 上使用任一个 PowerTyperTM Macros 须确认 macro 文件名
macro 的名字必须包
®
®
3100 遗传分析仪产生的数据 可用于 GeneScan®分析软件的 Windows NT®
version 识别
这些数据可直接导入 Windows NT® Genotyper® version 在这
®
version 前 必须运行一个转化效用 可从 ABI 获得 这
®
产生的数据可被 Macintosh® 软件识别
注意
确认等位基因梯度的每一行的"color info"栏中含有"ladder"这个词 Macro 使
用"ladder"这个词来确认含等位基因梯度的样品文件
理想的扩增样品峰高应小于 2,000 rfu
注意 本中文操作手册仅供实验参考 在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TBD016 如遇到问题请与 Promega 公司北
京办事处联系 TEL: 010-68498287 E-mail: techserv@promega.com.cn 技术手册号码 CTBD016
第 7 页 共 7页
对未标于此处的
问题
请与您当地
的办事处或分公
司联系
进一步的
资料可登陆网页
www.promega.com
疑难解答
VI
现象 可能原因 评论
少于 12 个毛
细管通过光
谱校正
Matrix 标准过度
稀释
Matrix 样品过度稀释 会导致峰值过低 如果
matrix 峰值小于 800rfu
一步中各片段的稀释度
减少本说明书 III.C 第
Matrix 标准太浓 Matrix 样品峰值太强 会在其它色谱中出现拉
升或消减
matrix 样品峰值过强
这可能导致光谱校正失败 如果
大于 6000rfu 提高本
说明书 III.C 第一步中各片段的稀释度并重复
光谱校正运行
少进样量
另一个选择是减少进样时间以减
VII. 相关产品
产品 包装 目录号
®
PowerPlex
16 System 100 reactions DC6531
400 reactions DC6530
PowerPlex® 1.2 System 100 reactions DC6101
400 reactions DC6100
不得用于医学诊断
其他组分
产品 包装 目录号
Internal Lane Standard 600 150
l DG2611
Fluorescent Ladder CXR, 60-400 Bases 65 l DG6221
Gold ST R 10X Buffer 1.2ml DM2411
Mineral Oil 12ml DY1151
Nuclease-Free Water 50ml P1193
仅供实验室使用
样品准备系统
产品 包装 目录号
®
DNA IQ
System 400 reactions DC6700
AluQuant® Human DNA Quantitation System 400 determinations DC1011
不得用于医学诊断
注意 本中文操作手册仅供实验参考 在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TBD016 如遇到问题请与 Promega 公司北
京办事处联系 TEL: 010-68498287 E-mail: techserv@promega.com.cn 技术手册号码 CTBD016
第 8 页 共 8页
Loading...