技术手册 Part# CTMD018
®
PowerPlex
DC6760和DC6761产品使用说明
原英文技术手册号码：TMD022
Y System
普洛麦格（北京）生物技术有限公司．北京市东城区北三环东路 36 号．环球贸易中心 B 座 907－909．
电话：010-58256268 传真：010-58256160 邮编 100013 www.promega.com.cn
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1. 介绍
STR（短串联重复序列）是由长度为 3-7 个碱基对的短串联重复序列组成的
（1-4）。这些重复序列广泛的存在于人类基因组中，是多态性标记的丰富来源。
并且这些位点可以通过聚合酶链反应来检测，扩增区域内重复序列的重复次数不
同导致 STR 位点的等位基因分型差异，在电泳分离后，通过放射性同位素、银染
和荧光检测可以区别不同的基因型。
位于 Y 染色体上的 STR 标记与常染色体上的标记不同，并且可以用于人身鉴定
（9-15）。Y-S TR 标记在 Y 染色体的非重组区域，并且在扩增男性 DNA 时生成单
倍体图谱。本产品通过去除扩增图谱中的女性提供物来简化男女混合样品的分析
过程。这些标记的精确父系遗传使它们可以用于亲子鉴定和亲缘关系分析的研究。
PowerPlex ®Y 系统可以进行 12 个位点的复合扩增和三色检测。此系统的扩增
位点包括：DYS19，DYS385a/b，DYS389Ⅰ/Ⅱ，DYS390，DYS391，DYS392，
DYS393，DYS437，DYS438 和 DYS439(18)。这些位点中，DYS389Ⅰ/Ⅱ，
DYS391，DYS439 的特异引物使用荧光素（FL）标记，DYS385a/b，DYS390，
DYS393 的特异引物使用羟基-四甲基罗丹明（TMR）标记，DYS19, DYS392,
DYS438 和 DYS437 的特异引物使用 6-羟基- 4´,5´-二氯 -2´,7´-二甲氧基-荧光素
（JOE）标记。全部的 12 个位点在同一管中同时扩增，然后通过单一进样或单一
胶道进行电泳分析。
PowerPlex ®Y 系统适用于 ABI PRISM ®310，3100 和 3100-Avant 型遗传分析
仪、Applied Biosystems3130 和 3130xl 型遗传分析仪 ABI PRISM ®377DNA 测序
仪上进行电泳分析。Promega 公司已对本手册中的操作流程进行了实验。但是由
于扩增及检测仪器的差异，各个实验室需要根据自己的仪器对实验中循环参数和
进样时间（或上样体积）进行调整优化。此外，还需进行实验室有效性验证。
PowerPlex ®Y 系统提供除 AmpliTaqGold ®DNA 聚合酶以外的所有扩增纯化的
基因组 DNA STR 区域所需的试剂。本操作手册分别介绍了使用 Perkin-Elmer480
型和 GeneAmp ®PCR 系统 9600，9700 和 2400 型热循环仪扩增 PowerPlex ®Y
系统的操作程序以及扩增产物、检测的操作流程（Figure1）。荧光检测仪器的操作
说明可以从仪器制造商处获取。
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如需获取进一步的 Promega 公司荧光 STR 系统的信息及银染法检测 STR 扩增
片段的方法，请登陆网站：WWW.promega.com 或与 Promega 公司联系。
Figure1
. Ⅱ 产品组份和储存条件
产品 规格 目录号
PowerPlex
此产品不得用于医疗诊断。
®
Y system
50 个反应
DC6761
Cat.# DC6761 提供的试剂，足够以 25μl 反应体系进行 50 次反应。其中包括：
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扩增前试剂盒组份（蓝色管盖）
1x300μl Gold ST R 10 x Buffer★
1x125μl PowerPlex®Y 10 x Primer Pair Mix
25μl 9948 Male DNA(10ng/μl)
25μl 9947A DNA(10ng/μl)
扩增后试剂盒组份（米黄色盖）
1x 12.5μl PowerPlex®Y Allelic Ladder Mix
1x 150μl Internal Lane Standard (ILS) 600
1 技术手册
产品 规格 目录号
®
PowerPlex
此产品不得用于医疗诊断。
Y system
200 个反应
DC6760
Cat.# DC6760 提供的试剂，足够以 25μl 反应体系进行 200 次反应。其中包括：
扩增前试剂盒组份（蓝色管盖）
2x300μl Gold ST R 10 x Buffer★
4x125μl PowerPlex ®Y 10 x Primer Pair Mix
25μl 9948 Male DNA(10ng/μl)
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25μl 9947A DNA(10ng/μl)
扩增后试剂盒组份（米黄色盖）
4x 12.5μl PowerPlex ®Y Allelic Ladder Mix
2x 150μl Internal Lane Standard (ILS) 600
1 技术手册
PowerPlex ®Y 系统等位基因 ladder 混合物在运输过程中保存于隔离、密闭
包装中。包装开启后应置于“扩增后”的盒中。
储存条件：所有组份要保存于-20冻存。PowerPlex ®Y 10 x Primer Pair Mix、
PowerPlex ®Y AllelicLadder Mix 及Internal Lane Standard (ILS) 600 对光敏感，
须避光保存。我们强烈推荐扩增前试剂与扩增后试剂要分开保存并使用不同的吸
头，试管架等。
单独提供的产品
产品 规格 目录号
*
Blue Dextran Loading Solution
PowerTyperTM Macros(Release)
*
实验室专用
**
不得用于医疗诊断
3ml DV4351
**
1CD-ROM DG3470
Promega 公司免费为您提供与Genotyper ®软件一起使用的PowerTyperTM
Macros（ 2.0版本）软件。CD-ROM 中包含与PowerPlex ®Y系统配合使用的
PowerTyperTM YMacro （ 2.0 版本）软件。您也可以从网站：
www.promega.com/geneticidtools/下载本软件。
与GeneMapper
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®
ID软件一起使用的相关的配套文件，您可以从Promega的网
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站：www.promega.com/geneticidtools/panels_bins/获得。
Matrix standard用于初始建立不同色的光谱矩阵文件，并可以针对不同的分析仪
型号单独购买。包括ABI PRISM ®310遗传分析仪和377 DNA测序仪的PowerPlex
®
Matrix Standards ，310 ；ABI PRISM
AppliedBiosystems 3130和3130xl型遗传分析仪的PowerPlex
®
3100 、3100-Avant型遗传分析仪和
®
Matrix Standards，
3100/3130。详细定购信息请参阅本手册章节IX.G。
Ⅲ 实验前必读
.Ⅲ A. 警示
此手册中未包含法庭及侵权案件中基于PCR的基因分型的应用需要有效性的研
究及质量控制措施（19，20）。DNA样品纯化的质量、缓冲液的微小差异、离子
强度、引物浓度，热循环仪的选择及热循环条件等都可能影响PCR的反应成功与
否，因此我们建议客户严格遵照操作手册推荐的扩增、变性胶电泳及荧光检测实
验程序。
微量的非模板人类DNA会对基于PCR的STR分析产生污染。当制备样品DNA、
处理引物对、进行扩增反应及分析扩增产物时，都要竭力避免交叉污染。扩增前
使用的试剂和原料（Gold ST★R 10×Buffer and PowerPlex ®Y 10×Primer Pair
Mix）应存放于一个单独的盒子中，并且要与扩增后使用的试剂和原料(PowerPlex
®
Y Allelic Ladder Mix和Internal Lane Standard 600）分开保存。每次反应须设立
没有模板DNA的阴性对照反应来监测试剂是否存在污染。我们强烈推荐您使用手
®
套及防回吸加样头（如ART
tips，见章节IX.G）。
一些用于STR产物分析的试剂含有潜在的毒性作用，应按照要求操作。Table1
列出了相关试剂的潜在毒性。
Table 1．毒性试剂
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适用于ABI PRISM ®310，3100，3100-Avant型遗传分析
仪及Applied Biosystems 3130和3130xl型遗传分析仪
危险性
的试剂
甲酰胺 刺激，致畸
适用于ABI PRISM ®377 DNA测序仪的试剂 危险性
丙稀酰胺（Long Ranger ®凝胶溶液） 可疑致癌物质，有毒
过硫酸铵 氧化剂、腐蚀剂
甲酰胺（包含在Blue Dextran Loading Solution中） 刺激，致畸
TEMED
腐蚀剂，可燃
尿素 刺激
III.B. Matrix标准化或光谱校正
在ABI PRISM
®
310, 3100和3100-Avant型遗传分析仪和Applied Biosystems
3130、3130xl型遗传分析仪上生成正确的Matrix文件，对评估多色荧光系统是非常
关键的。并且，每台分析仪都要有自己的Matrix文件。
PowerPlex ®Matrix Standards, 310（Cat.# DG4640）是专门为ABI PRISM ®310
遗传分析仪和ABI PRISM ®377 DNA测序仪进行Matrix标准化的。为了得到最佳的
®
实验结果，在ABI PRISM
310遗传分析仪上，不可使用PowerPlex ®Matrix
Standards, 3100/3130（Cat.# DG4650）生成Matrix文件。
PowerPlex
PRISM
®
®
Matrix Standards, 3100/3130（Cat.# DG4650）是专门为ABI
310, 3100和3100-Avant型遗传分析仪和Applied Biosystems 3130、
3130xl型遗传分析仪进行光谱校正的。在这些仪器上，不可使用PowerPlex
®
MatrixStandards, 310（Cat.# DG4640）生成Matrix文件。
有关Matrix标准化的操作流程和进一步的信息，可以参阅与产品DG4640同时附
送的PowerPlex ®Matrix Standards, 310, 技术手册 #TBD021。有关光谱校正的操
作流程及进一步的信息，可以参阅与产品DG4650同时附送的PowerPlex ® Matrix
Standards, 3100/3130, 技术手册 #TBD022。这些手册可以从Promega公司或登
陆网站 www.promega.com/tbs/ 获得。
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IV. 使用PowerPlex
®
Y系统进行DNA扩增
用户准备的材料
z 微量离心机
z 热循环仪Thermal Cycler Model 480或GeneAmp
®
PCR System 9600, 9700
或2400(Applied Biosystems)
z 0.5ml 或 0.2ml 薄壁微量离心管或MicroAmp
®
透光96 孔反应板(Applied
Biosystems)
z 1.5ml琥珀色微量离心管（Fisher，Cat.# 05-402-26）
z 防回吸吸头（参见章节IX.G）
z AmpliTaq Gold
®
DNA聚合酶（Applied Biosystems）
z 无核酸酶纯净水（Cat.# P1193）
z 石蜡油（Cat.# DY1151，用于Thermal Cycler Model 480）
根据下面的操作流程，我们在25μl反应体系中加入0.5-1ng模板DNA。由于小片
段基因座的优势扩增，如果加入过多的模板量，会出现小片段基因座相对峰高、
大片段基因座相对峰低的现象。这时减低模板量或减少循环次数可以纠正这个现
象。
®
使用GeneAmp
方法经过了优化。此外，本手册还提供了使用GeneAmp
PCR System 9700热循环仪对PowerPlex ®Y系统进行扩增的
®
PCR System 9600，9700
和2400热循环仪及Perkin-Elmer model 480热循环仪进行扩增的方法。
男性和女性DNA的混合样品总量必须要超过1ng。即使在有女性DNA存在的情况
下，此系统只扩增来自于男性的单模标本。要得到可信的结果，DNA的总量以及
男性和女性DNA的比例需要各自自己实验室的验证。在进行多个位点分析之前对
性别位点进行扩增和分析，这样可以提供一些关于男女DNA比例的信息。我们还
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提供针对单一性别位点，标记有荧光素（Cat.#DC5171）或TMR(Cat.#DC6171)，
的基因座扩增系统。
IV.A. 扩增体系的建立
为了防止交叉污染，我们强烈建议在试验过程中使用手套和防污染加样头。必
须将所有扩增前试剂和扩增后试剂分别放于不同的实验室。在专门的实验室内配
制扩增反应液，使用专门的仪器设备进行扩增反应。
为确保扩增的成功，在扩增时需要特别小心，我们在章节VII.A提供了一些扩
增中可能遇到的问题及解决方案。
1、 融化Gold ST★R 10×Buffer和PowerPlex ®Y 10×Primer Pair Mix。
注意：
（1） 每次使用前须将试剂漩涡振荡15秒以充分混匀。不要离心10×Primer Pair
Mix，那样会将引物离心至管底。
（2） 如果在Gold ST★R 10×Buffer中出现沉淀物质，可在37°C温浴，并漩涡振
荡使之溶解混匀。
2、 确定扩增样品数目，其中包含阴性及阳性对照。然后再增加1-2个反应数以抵
消移液误差。这个步骤也许会浪费少量试剂，但可以确保所有的样品均有足够
的PCR反应液，并且也可以确保每个反应管中含有相同体积的反应液。
3、 将一次性0.2m或0.5ml反应管置于架上并正确标记，或者使用MicroAmp ®反应
板并正确标记。
注意：如果使用GeneAmp ®PCR System 9600, 9700和2400热循环仪，则建议使
用MicroAmp ®8联反应管或MicroAmp ®反应板。对于Perkin-Elmer model 480热循
®
环仪，我们推荐使用0.5ml的GeneAmp
薄壁反应管。
4、将PCR各反应组分的终体积（参照Table 2）加至1.5ml无菌琥珀色小管中，轻
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微混匀。
Table 2中显示了每个反应中的组分体系组成。在章节IX.E中我们向您提供了
PCR反应液中每种成份用量的计算表
Table 2 PowerPlex ®Y系统扩增混合液
PCR反应混合液组分1 一份样本所加体积
去核酸酶纯净水 将终体积补至25μl
Gold ST★R 10×Buffer 2.5μl
PowerPlex ®Y 10×Primer Pair Mix 2.5μl
AmpliTaq Gold ®DNA聚合酶2 0.55μl（2.75U）
DNA模板（1ng）3
反应总体系
1、 先在PCR 混合液中加入去核酸酶纯净水，然后依次加入Gold ST★R 10×Buffer、
PowerPlex
模板。
2、 标准的AmpliTaq Gold
混合液中的酶的体积就要做相应的变动。
3、 DNA模板要溶解在去核酸酶纯净水或TE
EDTA）。如果溶解DNA模板的TE缓冲液PH值不为8.0、或者浓度过高，则DNA模板溶液
的加入体积不应超过最后PCR反应液总体积的20%。PCR反应的扩增效率以及扩增质量与
反应环境的PH值（取决于Tris-HCl的加入量）、镁离子浓度（取决于EDTA的螯和作用）
或者其他PCR抑制物等有关，这些成分的浓度也许很低，这取决于DNA模板的质量和DNA
提取方法。
®
Y 10×Primer Pair Mix和AmpliTaq Gold ®DNA聚合酶。在步骤6中会加入DNA
®
DNA聚合酶浓度为5u/μl。如果酶的浓度有所不同，那么加入到PCR
19.45μl
25μl
-4
缓冲液（10mM Tris HCl [pH 8.0], 0.1mM
当扩增的模板DNA量大于1ng时会导致位点之间峰值高度的不平衡，短片段
位点的扩增产量会高于长片段位点。这时，将扩增程序中的循环数减少2至4个循
环（例如，10/20或10/18个循环），可改善位点间的平衡。
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5、将混合的PCR反应液分装至每个反应管中。
6、向含有PCR反应液的反应管中加入相应样本的DNA模板（0.5-1 ng）。
7、设置扩增的阳性对照。稀释9948 DNA，使其在加入与样本相同的体积中含
0.5ngDNA。将稀释后含有0.5ngDNA的9947A加入到相应的装有PCR反应液的反
应管中。
8、设置扩增的阴性对照。将无核酸酶的纯净水（代替DNA模板）加入到相应的装
有PCR反应液的反应管中。
9、可选做：9947A （女性）DNA可以用来做为阴性对照来证明男性的特异性。
吸取适量DNA（必要的话可进行适当稀释）加入到装有PCR反应液的反应管中。
10、如果您使用GeneAmp ®PCR System 9600， 9700或 2400型热循环仪和
MicroAmp ®反应管或反应板，则无需在反应管中加入石蜡油。但是，如果您使用
的是480型热循环仪和GeneAmp ®反应管，则需要在每个反应管中加入1滴石蜡油。
注意：将石蜡油沿管壁滴下，覆盖PCR反应液，以防止PCR反应液蒸发或由于高
温致使PCR反应液喷溅而引起的交叉污染。
IV.B. 扩增循环参数设置
®
本操作手册提供使用Perkin-Elmer 480型和GeneAmp
PCR system 9600，9700
和2400型热循环仪扩增PowerPlex®Y System的操作流程。有关其他型号热循环仪
的相关信息请e-mail联系Promega技术服务部：Chinatech@promega.com
。
由于不同实验室扩增与检测仪器的灵敏度不尽相同，您需要根据您实验室仪器
的性能优化试验条件，包括扩增循环数、模板上样体积及电泳进样时间等。
Promega公司的测试结果显示，纯化后的DNA模板量在0.5-1ng时，10/22个循环
可以得到良好的扩增结果。对于高量的DNA模板（例如FTA ®纸卡）或者为了降低
灵敏度，而减少循环数，例如10/16，10/18或10/20，则需要进一步的优化评估。
必须进行实验室内的相关认证。
1、 将反应管或MicroAmp ®反应板置于热循环仪中。
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2、 选择并运行推荐的操作程序。下面提供了使用GeneAmp ®PCR system 9600，
9700和2400型和Perkin-Elmer 480型热循环仪进行扩增的推荐程序。
3、 热循环程序结束后，将扩增产物置于避光的盒子中保存在-20°C。
注意：将扩增产物保存在4°C或4°C以上的环境中，很可能会使产物降解。
1
当运行GeneAmp ®PCR 9700 型热循环仪时，必须设置循环程序中描述的温度变化速率，并
且此程序必须在9600 斜率模式（Ramp Mode）下运行。
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温度变化速率的设置在Ramp Rate Modification 界面。当浏览循环程序时，通过点击“More”，
然后选择“Modify”，就可以看到Ramp Rate Modification 界面。在Ramp Rate Modification界
面，每步温度变化速率都默认为100%。每个保温步骤下面的速率就是变温至此温度的速率。
Figure 2 显示了GeneAmp
环程序，即可以看到“Select Method Options”界面，此时可以设置“斜率模式”，选择“9600 Ramp
Mode”，然后输入反应体积。
®
PCR 9700 型热循环仪中的温度变化速率。选择“Start”启动热循
Figure 2． GeneAmp
®
PCR 9700 型热循环仪温度变化速率
V. 仪器设置及样品准备
使用ABI PRISM ®3100 或3100-Avant 型遗传分析仪，使用Version 2.0 版本
数据收集软件，或者，使用Applied Biosystems 3130 或3130xl 型遗传分析仪，
使用Version 3.0 版本数据收集软件，检测扩增片段。
用户准备的材料
• 95°C加热模块、水浴装置或热循环仪
• 碎冰和冰水混合物
• 防回吸吸头
• 3100或3130毛细管矩阵，36cm
• 用于3100或3130的Performance Optimized Polymer 4（POP-4™）
• 含EDTA 的10×遗传分析仪缓冲液
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• MicroAmp ®透光96 孔板和隔片
• Hi-Di™甲酰胺（Applied Biosystems，Cat.# 4311320）
• PowerPlex ®Matrix Standards, 3100/3130（Cat.# DG4650）
甲酰胺的质量对试验很重要，应使用电导率小于100μS/cm的Hi-Di™甲酰胺。
甲酰胺应分装置于-20°C冻存，反复冻融或长时间的置于4°C保存会导致甲酰胺的
降解。电导率高于100μS/cm的甲酰胺含有离子，在电泳进样时与DNA在发生竞争，
这样会使电泳图谱峰值减低并降低检测灵敏度。延长进样时间不能增强信号。
注意：甲酰胺为刺激性的致畸胎剂，应避免吸入以及直接接触皮肤。当操作
此类试剂时，请仔细阅读警告标签，并请戴手套与佩戴防护眼镜。
样本准备
1. 按照以下组分混合内标（ILS 600）和Hi-Di™甲酰胺，制备上样缓冲液：[(0.5μl
ILS 600) × (电泳样本量)] + [(9.5μl Hi-DiTM甲酰胺) × (电泳样本量)]
注意：可以通过增加或减少上样缓冲液中内标（ILS 600）的加入量，来调整内标
峰值的高度。ILS中100bp片段的理想峰值高度为500～1000 RFU。如果峰值过低，
我们建议改变甲酰胺/ISL的混合体积为：9.0μl甲酰胺中加入1.0μl ILS 600；如果峰
值过高，我们建议改变甲酰胺/ILS 600的混合体积为：9.75μl甲酰胺中加入0.25μl
ILS 600
2. 漩涡振荡10～15s混匀。
3. 在每孔中加入10μ甲酰胺/ILS混合缓冲液。
4. 加入1μl扩增产物（或1μl等位基因Ladder混合物）。用隔片将孔板覆盖。
5. 必要时略微离心进样板，以消除气泡。
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注意：不同实验室的仪器的检测灵敏度存在差异，因此需要适当调节进样时间或
扩增产物与上样缓冲液的混合比例。在“Data Colletion”软件中，使用“Module
Manager”中的“run module”来设置进样时间和电泳电压。如果图谱的峰值高
于预想值，可以用Gold ST★R 1×Buffer预先稀释扩增产物，然后再与上样缓冲液
混合。否则会引起位点间峰值高度的不均衡。为了得到更好的结果，可以在扩增
反应时减少模板DNA的量，或将热循环的循环数减少2～4个循环。
6. 将样本置于95°C变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后立即在遗传分析仪
上电泳。
仪器准备
参照仪器的“用户操作说明”进行毛细管矩阵的清洗和安装，并进行空间校正及
灌胶。使用2.0版本（version 2.0）数据收集软件进行样品分析时，按照ABI PRISM
®
3100或3100-Avant及3130或3130xl型遗传分析仪的用户操作手册，进行如下改
动：
1. 在“Module Manager”中点击“New”。在“Type”下拉菜单中选择“Regular”，然后
“Template”下拉菜单中选择“HIDFragmentAnalysis36_POP4”。确认进样时间为5
seconds、进样电压为3kV，将电泳时间延长为2000 seconds。为您这套新的运行
模式命名，然后点击“OK”。
注意：由于仪器灵敏度的差异，Module Manager中的进样时间和进样电压应做适
当调节。我们推荐的进样时间的范围为3～22 seconds，进样电压为1～3kV。
2. 在“Protocol Manager”中点击“New”，并为新程序命名。在“Type”下拉菜单中选
择“Regular”，然后在“Run Module”下拉菜单中选择在上一步骤中创建的运行模式。
最后，在“Dye-Set”中选择“F”（相应光谱校正使用的Dye set），点击OK。
3. 进入Plate Manager，参照仪器的用户使用说明书创建一个新的平板记录。在随
后出现的对话框中的Application下拉菜单中选择GeneMapper-Generic或预先指
定的选项，并且选择所用的平板类型（96-well），输入备注信息，点击OK。
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注意：如果希望对样本数据进行自动分析，请参照仪器的用户使用说明书。
4. 在GeneMapper ®平板记录中输入相应的样本信息，向右拉动滚动条，在Results
group 1栏目中选择期望进行结果分析的组，在InstrumentProtocol 1栏目中选择在
步骤2“Protocol Manager”中创建的新程序。确认所有样本的栏目中都包含了这些
信息，点击OK。
注意：在results group栏目的下拉菜单中点击New，可以创建一个新的结果分析组，
选择General tab，输入组名，选择Analysis tab，然后在Analysis type下拉菜单中
选择GeneMapper-Generic。
5. 将样品板放在仪器上，关上仪器门。
6. 在spectral viewer界面中，确认激活dye set F或相应光谱校正使用的Dye set，
并且对相应的dye set进行了正确地激活校正。
7. 在运行程序列表中，选中在步骤3、4中创建的样品板记录，并且单击使其变亮。
8. 一旦样品板记录被选中，点击与样品板中所加样本相对应的样品板图表。
9. 当样品板记录与样品板连接后，样品板图表将从黄色变成绿色，并且绿色的Run
Instrument的箭头按钮被激活。
10. 点击工具栏中绿色的Run Instrument的箭头按钮，样品开始电泳。
11. 通过观察运行状态、阵列以及收集软件中的毛细管视窗来控制电泳。每次电泳
用时约45分钟。
V.B. 用Version 1.0.1 or 1.1数据收集软件，使用ABI PRISM ®3100遗传分析仪检
测扩增片段
用户准备的材料
• 95°C加热模块、水浴装置或热循环仪
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• 碎冰和冰水混合物
• 防回吸吸头
• 3100毛细管矩阵，36cm
• 用于3100 Performance Optimized Polymer 4（POP-4™）
• 含EDTA 的10×遗传分析仪缓冲液
• 3100 专用MicroAmp®透光96孔板和胶盖
• Hi-Di™甲酰胺（Applied Biosystems，Cat.# 4311320）
• PowerPlex®Matrix Standards, 3100/3130（Cat.# DG4650）
甲酰胺的质量对试验很重要，应使用电导率小于100μS/cm的Hi-Di™甲酰胺。
甲酰胺应分装置于-20°C冻存，反复冻融或长时间的置于4°C保存会导致甲酰胺的
降解。电导率高于100μS/cm的甲酰胺含有离子，在电泳进样时与DNA在发生竞争，
这样会使电泳图谱峰值减低并降低检测灵敏度。延长进样时间不能增加信号强度。
注意：甲酰胺为刺激性的致畸胎剂，应避免吸入及直接接触皮肤。当操作此
类试剂时，请仔细阅读警告标签，并请戴手套并佩戴防护眼镜。
样本准备
1. 按照以下组分混合内标（ILS）和Hi-Di
™
甲酰胺，制备上样缓冲液：[(0.5μl ILS 600)
× (电泳样本量)] + [(9.5μl Hi-Di™甲酰胺) × (电泳样本量)]
注意：可以通过增加或减少上样缓冲液中内标（ILS）的加入量，来调整标准峰值
的高度。ILS中100bp片段的理想峰值高度为500～1000 RFU。如果峰值过低，我
们建议改变甲酰胺/ISL的混合体积为：9.0μl甲酰胺中加入1.0μl ILS600；如果峰值
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过高，我们建议改变甲酰胺/ILS 600的混合体积为：9.75μl甲酰胺中加入0.25μl ILS
600。
2. 漩涡振荡10～15s混匀。
3. 在每孔中加入10μl甲酰胺/ILS混合缓冲液。
4. 加入1μl扩增产物（或1μl等位基因Ladder混合物）。用隔片将孔板覆盖。
注意：不同实验室的仪器的检测灵敏度存在差异，因此需要适当调节进样时间或
扩增产物与上样缓冲液的混合比例。在“Data Colletion”软件中，使用“Module
Manager”中的“run module”来设置进样时间和电泳电压。如果图谱的峰值高
于预想值，可以用Gold ST★R 1×Buffer预先稀释扩增产物，然后再与上样缓冲液
混合。否则会引起位点间峰值高度的不均衡。为了得到更好的结果，可以在扩增
反应时减少模板DNA的量，或将热循环的循环数减少2～4个循环。
5. 必要时略微离心进样板，以消除气泡。
6. 将样本置于95°C变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后立即在遗传分析仪
上电泳。
仪器准备
®
参照ABI PRISM
3100型遗传分析仪的“用户操作说明”进行托板和毛细管矩阵的
清洗和安装，并进行空间校正及灌胶。
1. 打开ABI PRISM
®
3100数据收集软件。
2. 将GeneScan36_POP4DefaultModule模式的电泳时间改为2000秒。
3. 将进样电压改为3 kV。
4. 将进样时间改为11秒。
5. 将此运行模式以新名称保存（例如，
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GeneScan36_POP4PowerPlexY_3kV_11secs_2000），并最为所有运行程序的
初始模式。
6. 创建一个新的平板记录并命名，选择GeneScan，选择相应的平板型号（例如，
96-well），点击Finish。
7. 完成加样孔相应的平板记录表。在sample name和color info栏目中键入相应的
信息。对于等位基因ladder，在四色（蓝、黄、绿和红）的color info一栏中都
要键入“ladder”字样。为了能顺利的使用PowerTyper-Y Macro软件（2.0版本）
进行数据分析，必须正确的输入这些信息。
8. 在BioLIMS Project栏目的下拉菜单中选择3100_Project1。
9. 在Dye Set栏目的下拉菜单中选择Z。
10. 如果您使用ABI PRISM ®3100数据收集软件，版本1.0.1或1.1，在 Run Module
1栏目的下拉菜单中选择
GeneScan36_POP4PowerPlexY_3kV_11secs_2000。
11. 如果收集数据时不进行自动分析，则在Analysis Module 1 栏目中选择
NoSelection。完成数据收集后，使用GeneScan ®分析软件分析数据的过程中，
可以进行适当的分析参数设置。
12. 点击OK。新的平板记录将会出现在收集软件样品板设置页面中的待检测样品
板记录表中。
13. 将样品板放入仪器，并关上仪器门。
14. 在样品板记录表中，单击刚刚创建的待检测样品板记录。
15. 一旦待检测样品板记录被选中，点击与样品板中所加样本相对应的样品板图
表，使样品板与样品板记录表连接。
16. 当样品板记录与样品板连接后，样品板图表将从黄色变为绿色，样品板记录会
从样品板记录列表中移至连接的样品板记录列表中，并且激活Run Instrument
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按键。
17. 在工具栏中点击Run Instrument按键，样品开始电泳。
18. 通过观察收集软件中的运行状态、矩阵状态及毛细管视窗来监控电泳。每次电
泳时间约45分钟。
V.C. 使用ABI PRISM ®310遗传分析仪检测扩增片段
用户准备的材料
• 95°C加热模块、水浴装置或热循环仪
• 310毛细管矩阵，47cm × 50μm
• Performance Optimized Polymer 4（POP-4™）
• 玻璃注射器（1ml）
• 含EDTA的10×遗传分析仪缓冲液
• 样品管及胶盖
• 防回吸吸头
™
• Hi-Di
• PowerPlex
甲酰胺（Applied Biosystems，Cat.# 4311320）
®
Matrix Standards, 310（Cat.# DG4640）
• 碎冰或冰水混合物
甲酰胺的质量对试验很重要，使用电导率小于100μS/cm的Hi-Di™甲酰胺。甲
酰胺应分装置于-20°C冻存，反复冻融或长时间的置于4°C保存会导致甲酰胺的降
解。电导率高于100μS/cm的甲酰胺含有离子，在电泳进样时与DNA在发生竞争，
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这样会使电泳图谱峰值减低并降低检测灵敏度。延长进样时间不能增加信号强度。
注意：甲酰胺为刺激性的致畸胎剂，应避免吸入及直接接触皮肤。当操作此
类试剂时，请仔细阅读警告标签，并请戴手套并佩戴防护眼镜。
样本准备
1. 按照以下组分混合内标（ILS）和Hi-Di™甲酰胺，制备上样缓冲液：[(1μl ILS 600)
× (电泳样本量)] + [(24μl Hi-Di™甲酰胺) × (电泳样本量)]
注意：可以通过增加或减少上样缓冲液中内标（ILS）的加入量，来调整标准峰值
的高度。ILS中100bp片段的理想峰值高度为500～1000 RFU。如果峰值过高，我
们建议改变甲酰胺/ ILS 600的混合体积为：24.5μl甲酰胺中加入0.5μl ILS 600。
2. 漩涡振荡10～15s混匀。
3. 将25μl甲酰胺/ILS混合缓冲液与1μl扩增产物混合。
注意：不同实验室的仪器的检测灵敏度存在差异，因此需要适当调节进样时间或
扩增产物与上样缓冲液的混合比例。如果图谱的峰值高于预想值，可以用Gold
ST★R 1×Buffer预先稀释扩增产物，然后再与上样缓冲液混合。否则会引起位点
间峰值高度的不均衡。为了得到更好的结果，可以在扩增反应时减少模板DNA的
量，或将热循环的循环数减少2～4个循环（例如，10/18或10/20循环）。
4. 将25μl甲酰胺/ILS混合缓冲液与1μl PowerPlex ®Y等位基因Ladder混合。
5. 必要时略微离心进样板，以消除气泡。
6. 将样本置于95°C变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后尽快在遗传分析仪
上进行电泳。
7. 将样品管置于合适的自动进样托盘上（48或96管）。
8. 将自动进样托盘置于仪器内，关上仪器门。
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仪器准备
参照遗传分析仪的“用户操作说明”进行泵清洗、安装毛细管矩阵、校准自动进样托
盘及灌胶。
1. 打开ABI PRISM ®310数据收集软件。
2. 参照ABI PRISM ®310型遗传分析仪用户操作手册准备GeneScan
®
样品表。在
sample info栏目中输入相应的样品信息。在PowerPlex ®Y等位基因Ladder一
项的四色（蓝、黄、绿、红）sample info栏目中都要输入“ladder”一词，正确
的输入这些信息可是确保顺利的使用PowerTyper-Y Macro软件（2.0版本）对
数据进行分析。
3. 创建一个新的电泳进样清单。在下拉菜单中选择相应的样品表。
4. 在下拉菜单中选择GS STR POP4 (1ml) A模式，将进样时间改为3秒、电泳时
间改为27分钟，其余的参数设置如下：
Inj. Secs: 2-5
Inj. kV: 15.0
Run kV: 15.0
Run °C: 60
Run Time: 27
由于不同实验室仪器的检测灵敏度存在差异，进样时间需要做相应调整。当
含有的模板DNA的量为1ng，我们建议进样时间的范围在2～5秒。等位基因ladder
和样品的扩增数最好不超过32个，进样时间最长为5秒钟。应用高灵敏度仪器，扩
增的男性模板量大于1ng时，循环数为32个，并缩短进样时间。
注意：ABI PRISM ®310型遗传分析仪在进行长时间电泳后，由于毛细管温度或者
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其他方面的变化，电泳时片段的迁移率会发生微小的变化。当分析多个样本时，
在电泳的不同时间加入等位基因ladder有助于提高样本基因分型的准确性。
5.选择适当的Matrix文件（参见III.B）。
6.选择“auto analyze”及设置适当的分析参数、片段大小标准，可以对数据进行自
动分析。参照ABI PRISM ®310型遗传分析仪用户操作手册，可以获得进一步信
息。
7. 装载样品板，关闭仪器门，点击Run，开始毛细管电泳。
8. 通过观察原始数据和运行状态视窗来监控电泳。每个样本从进样到电泳完成大
约需要40分钟。
V.D. 使用ABI PRISM ®377 DNA测序仪检测扩增片段
需用户准备的材料
（溶液组分列于章节IX.F.）
• Long Ranger ®凝胶液（Cambrex，Cat.# 50611）或用于ABI 377-36cm的Long
Ranger Singel ®pack（Cambrex，Cat.# 50691）。
• 10%过硫酸铵（Cat.# V3131）。
• TEMED。
• TBE 10×buffer 缓冲液。
• Nalgene ®组织培养滤过器（0.2微米）。
• 36cm 前后玻璃板。
• 36cm 凝胶垫片（0.2mm 厚）。
• 36-孔鲨鱼齿梳或34-孔方齿梳（0.2mm厚）。
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• 夹子（例如，大的办公室夹子）。
• 凝胶上样吸头。
• 防回吸吸头（参照IX.G.）。
• Liqui-Nox®或其他清洁剂。
• PowerPlex® Matrix Standards, 310（Cat.# DG4640）。
• Blue Dextran Loading Solution（Cat.# DV4351）。
• 碎冰或冰水混合物。
• 95°C加热模块、水浴箱或热循环仪。
注意：丙烯酰胺（Long Ranger ®凝胶液）有神经毒性和致癌作用，应避免吸入及
直接接触皮肤。操作前应仔细阅读警示标签并做好防护措施，操作时应佩戴手套
及防护眼镜。
制备丙烯酰胺凝胶
以下介绍在ABI PRISM ®377 DNA测序仪上进行36cm变性聚丙烯酰胺凝胶电泳准
备工作的操作流程。我们推荐使用低荧光玻璃板，其可以从仪器供应商处获得。
1. 使用热水和1% Liqui-Nox ®溶液彻底清洗玻璃板，然后用去离子水彻底冲洗，
并将玻璃板置于无尘埃环境中空气干燥。
2. 将0.2mm厚的凝胶垫片置于前后玻璃板中间，用夹子（每边4个）将前后玻璃
板固定。将安装好的玻璃板水平放在试管架或类似的支撑物上。
3. 参照Table 3所列的组分混合（总体积为50ml），制备5% Long Ranger ®丙烯
酰胺凝胶。不断搅拌溶液直至尿素完全溶解。
Table 3. 制备5％Long Ranger ®丙烯酰胺凝胶
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组份 5%凝胶 终浓度
尿素
去离子纯净水
18g 6M
26ml
——
10×TBE 5ml 1×
50％Long Ranger ®凝胶溶液
总体积
5ml
50 ml
5％
注意：可能需用Long Ranger Singel ®Pack。
4. 将丙烯酰胺凝胶用0.2微米的滤膜（例如，Nalgene ®组织培养滤过器）过滤，
并去气泡5分钟。
5. 向50ml的丙烯酰胺凝胶中加入35μl TEMED和250μl新配置的10%过硫酸铵，并
轻轻搅拌、混匀。
6. 使用一次性60cc注射器将胶液由玻璃板底部小心灌入水平的玻璃板之间，使凝
胶注满至玻璃板顶部。灌注时为使凝胶持续注入，可以轻轻敲打玻璃板，并防
止产生气泡。
7. 在玻璃板间插入36-孔鲨鱼齿梳或34-孔方齿梳。也可使用64-孔或96-孔鲨鱼齿
梳。
8. 使用3个夹子均匀固定齿梳。
9. 将剩余的丙烯酰胺溶液作为凝胶聚合反应的参照物。
10. 凝胶聚合反应应持续2小时以上。检查凝胶聚合反应参照物，以确保聚合反应
完全。
注意：将胶板的顶端及底端用去离子水饱和的纸巾和塑料薄膜密封，以防止胶干
（尿素结晶会损坏胶），可使胶保存过夜。
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1. 打开ABI PRISM ®377数据收集软件。
2. 参照GeneScan
®
分析软件用户操作手册准备样品表。在sample info栏目中输入
相应的样品信息。在PowerPlex ®Y等位基因Ladder一项的四色（蓝、黄、绿、
红）sample info栏目中都要输入“ladder”一词，正确的输入这些信息可是确保
顺利的使用PowerTyper-Y Macro软件（2.0版本）对数据进行分析。
3. 按照下列设置，创建一个新的GeneScan ®电泳模式：
Plate Check Module（平板检测模式）： Plate Check A
PreRun Module（预电泳模式）： PR GS 36A-2400
Run Module（电泳模式）： GS 36A-2400
Collect time（收集时间）： 2.5 hours
Well-to-Read distance（读孔距离）： 36cm
4. 在下拉菜单中选择适当的样品表和齿梳类型。
5. 选择适当的凝胶Matrix文件（参见章节III.B）。
凝胶预电泳
1. 从聚合的丙烯酰胺凝胶上取下夹子。必要时，用蘸有去离子水的纸巾擦净玻璃
板上溢出的丙烯酰胺。
2. 刮除齿梳周围多余的丙烯酰胺并移去齿梳。如果使用鲨鱼齿梳，小心的将梳齿
插入胶中约1~2mm。
3. 将凝胶/玻璃平板装入377卡槽并固定。
4. 根据ABI PRISM ®377 DNA测序仪用户操作手册推荐的方式将卡槽在仪器中固
定并检查平板，如果基线不水平，须移动卡槽，清洁平板表面，然后重新检查
平板。
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5. 在仪器顶端及底部的缓冲液槽中加入1×TBE缓冲液。
6. 使用60cc注射器注满缓冲液，并去除凝胶齿梳孔内的气泡，然后盖好顶端的缓
冲液槽。用18-号针头的注射器除去凝胶底部的气泡。
7. 装上加热板，接好水管，连接所有电极，关闭仪器门，点击PreRun开始预电泳。
将预电泳进行15~20分钟或电泳至凝胶温度升至40°C。通过状态视窗可以监控
凝胶温度。
8. 在凝胶预电泳期间，准备样品和等位基因ladder。
样品准备及上样
1. 按照以下组分混合内标（ILS 600）和 Blue Dextran上样溶液，制备上样缓冲液：
[(0.5μl ILS 600) × (电泳样本量)] + [(1.5μl Blue Dextran上样溶液) × (电泳样本量)]
注意：上样缓冲液中内标的体积可以根据标准片段峰值的高低进行调整。
2. 漩涡振荡10~15s混匀。
3. 将1.0μl扩增产物与2.0μl制备好的上样缓冲液混合。
注意：不同实验室的仪器的检测灵敏度存在差异，因此需要适当调节进样时间或
扩增产物与上样缓冲液的混合比例。如果图谱的峰值高于预想值，可以用Gold
ST★R 1×Buffer预先稀释扩增产物，然后再与上样缓冲液混合。否则会引起位点
间峰值高度的不均衡。为了得到更好的结果，可以在扩增反应时减少模板DNA的
量，或将热循环的循环数减少2～4个循环（例如，10/18或10/20循环）。
4. 将1.0μl PowerPlex ®1Y Allelic Ladder与2.0μl制备好的上样缓冲液混合。混合
前将Allelic Ladder混合液充分振荡混匀。
5. 将样本略微离心，使管中的全部成分聚于管底。
6. 将样本95°C变性3分钟，然后迅速置于冰上冷却，变性后的样本尽快上样。
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7. 15~20分钟的预电泳后，点击Pause键暂停仪器。在上样期间，水会持续循环以
保持凝胶的温度。
8. 使用充满缓冲液的带有18-号针头的60cc注射器冲去加样孔内的尿素。
9. 在每孔内上样1.5μl变性的样本。
不同的仪器，需要对上样体积进行优化，我们推荐上样体积为1.0~2.0μl。将
顶部缓冲液槽加盖，关闭仪器门。
10. 将顶部缓冲液槽加盖，关闭仪器门。
凝胶电泳及检测
1. 上样结束后，点击Cancel，结束预电泳。确证将电泳时间（run time）设置为
2.5小时，点击Run开始电泳。
2. 通过观察凝胶图像和状态视窗，可以监控电泳。
3. 电泳2.5小时后，600bp的内标片段通过扫描窗。
4. 追踪、提取胶道。
玻璃平板的重新使用
分开玻璃平板，弃去凝胶。使用热水和1% Liqui-Nox ®清洁剂彻底清洁玻璃平板，
然后用去离子水冲洗玻璃板，最后将平板空气干燥。在此过程中不要划伤玻璃板。
注意：残留的肥皂和油污会引起鼓胶或背景不洁。可将玻璃板置于2N HCl中浸泡
15分钟，之后彻底清洗。
VI. 数据分析
VI.A. GeneMapper
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®
ID（3.2版本）PowerPlex
第 27 页
®
Panel和Bin的设置
为了便于对由PowerPlex ®YSystem得到的数据进行分析，我们创建了可以使
GeneMapper
用GeneMapper
GeneMapper
规操作。对于使用GeneMapper
®
ID软件（3.2版本）进行自动基因分型的Panel和Bin文件。对于使
®
ID软件（3.2版本）的用户，我们建议全面阅读AppliedBiosystems
®
ID Software Human Identification Analysis Tutorial，熟悉软件的正
®
ID软件（3.1版本）的用户，我们建议将软件升级
至3.2版本。
预先准备
®
1. GeneMapper
ID 的用户可以从Promega 公司网址：
www.promega.com/geneticidtools/panels_bins/ 获得相应的Panel和Bin文
件。
2. 输入您的联系信息，选择GeneMapper ID version 3.2，点击Submit。
3. 点击链接PowerPlex
®
Panels & Bin Sets，将.zip文件保存在电脑中。
4. 使用Windows ®WinZip程序打开文件，将解压缩后的文件存入电脑相应的位置。
导入Panel和Bin文件
这些指令说明应参照Applied Biosystem GeneMapper
®
ID软件使用指南：
1. 打开GeneMapper ID软件，版本3.2。
2. 打开Tool中的Panel Manager。
3. 点亮左侧板块上方（导向窗格）的Panel Manager图标。
4. 打开File中的Import Panels。
5. 遵循指令保存Panel和Bin文件。选择Promega_Panels_ID3.2.X.txt.（其中X指
Panel和Bin文件最新的版本号），点击Import。
6. 在导向窗格中，点亮刚导入的Promega_Panels_ID3.2.X文件夹。
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第 28 页
7. 打开File中的Import Bin Set。
8. 遵循指令保存Panel和Bin文件。选择Promega_Bins_ID3.2.X.txt.，点 击 Import。
9. 在Panel Manager视窗的底部，点击Apply，然后点击OK。Panel Manager视窗
会自动关闭。
VI.B. 创建使用GeneMapper
些指令说明应参照Applied Biosystem GeneMapper
®
ID软件进行案件（Casework）数据分析的方法这
®
ID软件使用指南。
1. 打开Tool中的GeneMapper Manager。
2. 点击Analysis Methods界面。
3. 点击New，会打开一个新的分析方法编辑对话框。
4. 选择HID，点击OK。
注意：如果您没有看到HID选项，表明您没有安装GeneMapper
过email：Chinatech@promega.com 与Promega技术服务部门取得联系，
获得帮助信息。
5. 键入对此分析模式的命名，例如PowerPlex Y advanced。
®
ID软件。可以通
6. 点击选择Allele界面（Figure 3）。
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Figure 3. Allele界面。在Bin设置中选择Promega_Bins_ID3.2.X.txt，其中X指Bin文件最新的
版本号。
7. 在Bin设置中选择与PowerPlex System相对应的Promega_Bins_ID3.2.X.，其中
X指Bin文件最新的版本号。
8. 确定选中Use marker-specific stutter ratio if available栏目。
9. 在使用PowerPlex®Y System时，参照Figure 3输入相应的数值，以适当的滤过
Stutter 峰。如果需要获得此项设置的用途及产生的影响，请参阅Applied
Biosystems 用户手册中的Installation Procedures and NewFeatures for
GeneMapper ID Software 3.2。
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注意：其中的一些设置是经过优化的，可能会与Applied Biosystems用户手册中的
推荐设置存在差异。
10. 点击选择 Peak Detector 界面。我们推荐使用 Figure 4 中的设置。
注意：分析片段可以选择“全片段分析（full range）”或“部分片段分析（partial range）
用部分片段分析功能，根据电泳数据选择适当的分析片段：将引物峰后第一个制
定的内标峰前作为起点，并且通过内标的片段值可以确定起点值。
Figure 4. Peak Detector 界面
11. 点击选择 Peak Quality 界面。您可以改变 Peak Quality 的设置。
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12. 点击选择 Quality Flags 界面。也可以改变其中的设置。
注意：对于步骤11、12的设置，请参阅GeneMapper
®
ID用户使用手册获得更多的
帮助信息。
13. 点击 OK，保存设置修改。
创建标准片段
1. 打开Tool中的GeneMapper Manager。
2. 点击选择Size Standard界面。
3. 点击New。
4. 选中Basic or Advanced（Figure 5）。选择的分析方法的模式必须与先前创建
的分析方法模式相匹配。点击OK。
5. 在 Size Standard Editor 界面（Figure 6 ），输入相应的命名，例如ILS
600advanced。
6. 选择红色（Red）作为标准片段颜色。
7. 输入标准片段的标准值（参见章节IX.E，Figure 13）。
8. 点击 OK。
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Figure 5．Select Dye and Analysis Methed 视窗
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Figure 6．标准片段编辑
案件（Casework）样本数据处理
1. 参照 Applied Biosystems GeneMapper® ID Software HumanIdentification
Analysis Tutorial，向新的计划表（Project）导入样本文件。
2. 在Sample Type栏目中，使用下拉菜单标明样本类型（Ladder、Sample、Positive
Control或Negative Control）。计划表中的每个文件必须包含一个Ladder，以
进行正确的分型分析。
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3. 在Analysis Method栏目中，选择先前在章节“Creating a Casework Analysis
Method”中创建的分析方法。
4. 在Panel栏目中选择PowerPlex_Y_ID3.2.X，其 中X指Panel文件最新的版本号。
在章节VI.A中导入此Panel设置。
5．在Size Standard栏目中，选择先前在章节“Creating a Size Standard”中创建的
片段标准。
6. 如果分析数据来自ABI PRISM ®310型遗传分析仪或ABI PRISM ®377 DNA测序
仪，须确保在Matrix栏目中选择适当的Matrix文件。
7. 点击Analyze（绿色箭头键），开始数据分析。
VI.C. 使用 GeneMapper
®
ID 软件创建数据库或进行亲子鉴定方法
1. 打开 Tool 中的 GeneMapper Manager。
2. 点击 Analysis Methods 界面。
3. 点击 New，会打开一个新的分析方法编辑对话框。
4. 选择 HID，点击 OK。
注意：如果您没有看到HID选项，表明您没有安装GeneMapper
®
ID软件。可以通
过email：Chinatech@promega.com 与Promega技术服务部门取得联系，获得
帮助信息。
5. 对此分析模式进行描述性的命名，例如 PowerPlexY_20%filter。
6. 点击选择 Allele 界面。
7. 在 Bin 设置中选择与 PowerPlex ®System 相对应的 Promega_Bins_ID3.2.X.，
其中 X 指 Bin 文件最新的版本号。
8. 确定选中Use marker-specific stutter ratio if available栏目。
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9. 在使用PowerPlex ®Y System时，参照Figure 7输入相应的数值，以适当的滤过
Stutter杂峰。如果需要获得此项设置的用途及产生的影响，请参阅Applied
Biosystems 用户手册中的Installation Procedures and New Features for
GeneMapper ID Software 3.2。
Figure 7．使用20%杂峰滤过设置的Allele界面。选择Promega_Bins_ID3.2.X.txt，其中X指
Bin文件最新的版本号
创建标准片段
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1. 打开Tool中的GeneMapper Manager。
2. 点击选择Size Standard界面。
3. 点击New。
4. 选中Basic or Advanced（Figure 5）。选择的分析方法的模式必须与先前创建
的分析方法模式相匹配。点击OK。
5 ．在Size Standard Editor 界面（Figure 6 ），输入相应的命名，例如ILS
600advanced。
6. 选择红色（Red）作为标准片段颜色。
7. 输入标准片段的标准值（参见章节IX.E，Figure 13）。
8. 点击OK。
数据库或亲子鉴定样本数据处理
1. 参照Applied Biosystems GeneMapper ®ID Software Human Identification
Analysis Tutorial，向新的计划表（Project）导入样本文件。
2. 在Sample Type栏目中，使用下拉菜单标明样本类型（Ladder、Sample、Positive
Control或Negative Control）。计划表中的每个文件必须包含一个Ladder，以
进行正确的分型分析。
3. 在 Analysis Method 栏目中，选择先前在章节“Creating a Databasing or
Paternity Analysis Method”中创建的分析方法。
4. 在Panel栏目中选择PowerPlex_Y_ID3.2.X，其 中X指Panel文件最新的版本号。
在章节VI.A中导入此Panel设置。
5．在Size Standard栏目中，选择先前在章节“Creating a Size Standard”中创建的
片段标准。
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6. 如果分析数据来自ABI PRISM ®310型遗传分析仪或ABI PRISM ®377DNA测序
仪，须确保在Matrix栏目中选择适当的Matrix文件。
7. 点击Analyze（绿色箭头键），开始数据分析。
VI.D. 使用GeneScan ®软件和PC操作系统分析样本数据
1. 使用GeneScan ®分析软件分析数据。
2. 浏览一个或多个样本电泳的原始数据。点亮样本的文件名，在Sample菜单中点
击raw data。移动光标使十字标线落在引物峰右侧的基线上（第一个红色内标
标准峰之前），将屏幕左下侧显示的X轴数值记为分析参数中的起始值。
3. 推荐的分析参数设置参见Figure 8。
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Figure 8．分析参数视窗分析范围的起点因仪器不同而不同，具体说明请参阅章节VI.D，步骤
2
4. 分析参数会被保存在Params 文件夹，大多数系统中，这个文件夹位于：
C:\AppliedBio\Shared\Analysis\Sizecaller\Params
5. 将保存的分析参数应用于样本分析。
6. 标记新的标准片段（size standard）。选择一个样本文件，点亮标准片段（size
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standard）旁边的箭头，点击Define New，参照章节IX.D中的Figure 13标注标
准片段峰值。保存标准片段的Size Standards 文件夹位于：
C:\AppliedBio\Shared\Analysis\Sizecaller\SizeStandards
7. 将标准片段文件应用于样本，进行样本文件分析。如需获得进一步使用
PowerTyper. Y Macro（版本2.0）和GeneScan ®软件的帮助信息，请参阅章
节VI.F。
注意：
1. 如果峰值高度超出仪器的线性范围，由于仪器的饱和（例如上样量过大），会
产生人为的杂峰。同时会观察到一种颜色向另一种颜色的渗透（拉升），另外
饱和信号可能会以双峰（峰顶裂开）的形式出现。
2. 如果峰高不在仪器检测的线性范围内，杂峰与实际等位基因峰高的比率会升高，
给等位基因的分型及判读造成困难，也会影响各峰高的均衡性。
3. 同一样本在不同仪器上检测得到的相对荧光单位可能不同。另外，不同仪器对
荧光相对检测效率的不同会影响颜色间的平衡性。
VI.E. 使用GeneScan ®软件和Macintosh ®（苹果机）操作系统分析样本数据
®
1. 使用GeneScan
分析软件分析数据。
2. 浏览一个或多个样本电泳的原始数据。点亮样本的文件名，在Sample菜单中点
击raw data。移动光标使十字标线落在引物峰右侧的基线上（第一个红色内标
标准峰之前），将屏幕左下侧显示的X轴数值记为分析参数中的起始值。
3. 以下为推荐的分析参数设置：
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1
平滑度选择由各实验室自行决定。如果使用heavy smoothing，偶尔会出现不能区分TH01等
位基因9.3和10位点。
2
峰阈值（peak amplitude thresholds）是指软件可识别的最小峰高值。其由实验室自行决定，
一般为50~200 RFU。
4. 分析参数会被保存在Params文件夹。
5. 将保存的分析参数应用于样本分析。
6. 标记新的标准片段（size standard）。选择一个样本文件，点亮标准片段（size
standard）旁边的箭头，点击Define New，参照章节IX.D中的Figure13标注标
准片段峰值。将标准片段保存于Size Standards文件夹。
7. 将标准片段文件应用于样本，进行样本文件分析。如需获得进一步使用
®
PowerTyper. Y Macro（版本2.0）和GeneScan
软件的帮助信息，请参阅章
节VI.F。
如需获得有关使用GeneScan
®
分析软件的进一步信息，请参阅GeneScan
®
Analysis Software User,s Manual。
注意：
1.峰值高度超出仪器的线性范围，由于仪器的饱和（例如上样量过大），会产生人
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第 41 页
为的杂峰。同时会观察到一种颜色向另一种颜色的渗透（拉升），另外饱和信
号可能会以双峰（峰顶裂开）的形式出现。
2. 如果峰高不在仪器检测的线性范围内，杂峰与实际等位基因峰高的比率会升高，
给等位基因的分型及判读造成困难，也会影响各峰高的均衡性。
3. 同一样本在不同仪器上检测得到的相对荧光单位可能不同。另外，不同仪器对
荧光相对检测效率的不同会影响颜色间的平衡性。
VI.F. 使用Genotyper ®和PowerTyperTM Y Macro软件分析样本数据
为了便于对由PowerPlex ®Y System得到的数据进行分析，我们创建了可以使用
Genotyper ®软件进行自动基因分型的文件。当样本使用PowerPlex ®Y System扩
增后，使用ABI PRISM ®310或3100型遗传分析仪（使用1.0.1或1.1版本数据收集
软件），或ABI PRISM ®377 DNA测序仪进行检测，数据通过GeneScan ®分析软
件分析后，将样本文件导入Genotyper ®程序，并由PowerTyperTM Y Macro软件（版
本2.0）分析。
Promega公司提供PowerTyperTM Y Macro软件（版本2.0）。PowerTyper
Macro软件（版本2.0）以PowerTyper
TM
Macros CD-ROM（Cat#，DG3470）的
TM
Y
形式提供，也可登陆网站：www.promega.com/geneticidtools/ 下载。
PowerTyperTM Y Macro软件（版本2.0）须与Macintosh
®
Genotyper
®
2.5版本
及 Windows NT® Genotyper® 3.6 或更高版本软件配套使用，因此在使
PowerTyperTM Y Macro软件（版本2.0）之前，需要在计算机上安装Genotyper
软件。
®
需要确定在sample info（Macintosh®电脑）或color info（Windows NT®电脑）
栏目中的等位基因Ladder一栏含有“ladder”一词。Macro通过识别“ladder”来确认含
有等位基因Ladder的文件。可在导入PowerTyper
TM
Macro后继续添加或修改
Sample info，点亮样本，在Views下拉菜单中选择show dye/lanes window。
TM
1. 在计算机硬盘上的指定区域从PowerTyper
DG3470）转载或从Promega网站下载，安装PowerTyper
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Macros CD-ROM（ Cat ＃，
TM
Y Macro 2.0版本。
2. 打开Genotyper®软件及PowerTyperTM Y Macro 2.0 版本软件。有关
Genotyper
®
软件遇到的问题，请参阅Genotyper® Analysis Software User,s
Manual。
3．在主菜单File中点击Import，导入待分析的样本文件。分别输入蓝、黄、绿、
红四色。
注意：在Edit菜单下选择Set Preferences，可以选择导入的荧光颜色。
4. 双击Check ILS指令（图标位于窗口左下侧），将会有窗口显示红色荧光的内
标情况（ILS 600）。向下滚动窗口，确认内标片段标记正确。如果必要的话，
可以使用GeneScan ®软件重新分析样本数据，重新标记内标片段。
注意：软件只使用一个等位基因Ladder来度量等位基因片段大小。Macro使用输入
的第一个等位基因Ladder对样本进行分型。
5. 对于案件样本（Casework），双 击 POWER指令。POWER指令可以识别Ladder
样本中的等位基因并且计算全部基因座。此过程需要几分钟，结束后会打开显
示等位基因Ladder（例如，Penta E，D18S51，D21S11，TH01及D3S1358
等）的窗口。
另外，对于数据库或亲子鉴定，双击POWER 20% Filter指令，其与标准POWER
指令相比具有更高的滤过阈值基准，可以省去对峰值标注的人工编辑过程。但
POWER 20% Filter指令不可用于混合样本的分析。
一般来讲，等位基因Ladder包含了与已知位点等位基因长度相同的片段，它们
®
的片段大小及重复单位列于Table 5（章节IX.B）。通过使用GeneScan
Genotyper
®
分析软件将样本扩增片段与等位基因Ladder和内标进行比较，从而
和
达到分型的目的。当使用内标（ILS）计算等位基因Ladder长度时，可能与表中
所列数据有所差异，这是由于等位基因Ladder与内标（ILS）序列不同而导致的
电泳迁移差异所致。
6. 双击Allelic Ladders指令，窗口中会显示蓝色荧光标记（Fluorescein）的等位
基因Ladders（例如，DYS391，DYS389 ,DYS439Ⅰ 和DYS439Ⅱ），绿色荧光
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标记（JOE）的等位基因Ladders（例如，DYS438，DYS437,DYS19和DYS392），
及黄色荧光标记（TMR）的等位基因Ladders （例如，DYS393,DYS390和
DYS385）。确认等位基因Ladders标记全部正确。(Figure 10 章节 .H )Ⅵ 。
注意：软件只使用一个等位基因Ladder来度量等位基因片段大小。Macro一般
使用输入的第一个等位基因Ladder对样本进行分型。如果POWER指令运行2
次，软件会使用第二个Ladder；如 果 POWER指令运行3次，软件会使用第三个
Ladder，依此类推，直到计划表中所有的Ladder被使用。如果一个等位基因
Ladder分析失败，或者如果在样本中出现许多Off-Ladder等位基因，则需要使
用计划表中另外的等位基因Ladder，对样本进行重新分析。
7. 双击Display Fluorescein Data指令，展示全部样本的蓝色荧光标记峰，可根据
需要进行编辑。
8. 双击Display TMR Data指令，展示全部样本的黄色荧光标记峰，可根据需要进
行编辑。
9. 双击Display JOE Data指令，展示全部样本的绿色荧光标记峰，可根据需要进
行编辑。
10. 通过选择Power Table、Make Allele Table或Make CODIS Table指令，来创
建合适的表格，可以得到以下3种图表。其中，Power Table选项可以允许每个
样本有4个等位基因，还包括低峰信号和高峰信号；Allele Table和CODIS Table
选项每个基因座只包含2个等位基因，如果多于2个则会包含最小的。Allele
Table将每个基因座确定为一组（Categories）来显示不同等位基因的数据，而
CODIS表则以行的形式来显示。这些表格可以根据实验室的需求而进行优化。
如果需要保存桌面数据，在Table下拉菜单中点亮Export to File，可以将文件以
指定的文件名存入指定的位置。保存的文件可以使用Microsoft® Excel进行浏览
的分析。
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11. 在File菜单中点击Save as，保存分析数据。
PowerTyperTM Macro是Genotyper ®中的软件，如果使用Save而非Save
as，文件会被取代。
VI.G. 对照
1. 观察阴性对照结果。阴性对照结果中不应有扩增产物。
2. 观察9948阳性对照男性DNA结果。将对照DNA等位基因重复片段与特殊位点的
等位基因Ladder对比。预期的9948 DNA等位基因全部位点分型参见Table 5
（章节IX.B）。
VI.H. 结果
®
PowerPlex
Y System典型的结果图谱参见Figure 9。PowerPlex ®Y Allelic
Ladder Mix结果参见Figure 10。
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Figure 9. PowerPlex ®Y System
使用PowerPlex ®Y10×Primer Pair Mix扩增单一男性模板DNA（0.5ng）。将扩增产物与内标
ILS600混合，在Applied Biosystems3130型遗传分析仪上，使用3kV电压、3秒进样时间模式
进行电泳检测。电泳结果使用GeneMapper ®ID软件（3.2版本）进行分析。Panel A. 使用荧
光素（FL）标记位点的电泳峰图：DYS391，DYS391Ⅰ，DYS439，和DYS389Ⅱ。Panel B.
使用JOE-标记位点的电泳峰图：DYS438，DYS437，DYS19和DYS392。Panel C. 使用TMR-
标记位点的电泳峰图：DYS393，DYS390和DYS385。
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®
Figure 10．PowerPlex
在Applied Biosystems 3130型遗传分析仪上，使用3kV电压、3秒进样时间模式PowerPlex
System等位基因Ladder混合液进行电泳检测。电泳结果使用GeneMapper
和PowerPlex
®
Y的Panel和Bin文件进行分析。Panel A. 荧光素（FL）标记的等位基因成分及
Y System等位基因Ladder混合液。
®
ID软件（3.2版本）
®
全部等位基因分型。Panel B. JOE-标记的等位基因成分及全部等位基因分型。Panel C. TMR-
标记的等位基因成分及全部等位基因分型。
非特异峰和阴影带
阴影带是在STR分析中经常出现的扩增非特异产物，对于相同的基因座，它的图
形及强度会因为使用不同的引物而不同，这是反应、扩增条件以及标记链的方向
的差异引起的。对于高信号/模板比值的样品，影子带产物经常出现在正确等位基
因峰以下1个偶尔是2个重复单位处（表4）。除了影子带峰以外，有些 PowerPlex
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Y
®
Y 基因座处也可观察到一些类似于影子带的峰。对于高信号/模板比值的DYS392
基因座及偶尔可见的其它基因座可出现大于正常等位基因1 个重复的峰。DYS19
及DYS389II 会在 n-2 和 n +2 的位置（低于或高于正常等位基因2 个碱基）出
现低水平产物，对于 DYS19, n-2 产物最为常见。 DYS437及DYS385 也可以在
n-5 位置出现低水平峰，DYS437 ，DYS385和DYS393 出现 n -9 产物。
影子带及影子带类似峰的强度与信号强度直接相关，结果可以根据实验室的情况
进行优化。应该进行实验室内部的确认实验。
在 JOE 标记的峰DYS438,无等位基因出现的区域会出现低水平假峰，位置大约
114-120bp 处。这些假像不是因为模板而引起的，而且在阴性对照及低产量产物
分析中也会出现。这些假峰的峰高会随着进样时间的增加或电压的升高而增加。
除此之外，在DYS393和DYS390之间的未命名区域会看到低水平的假峰，并且在
TMR荧光通道中的150－165bp位置上也会看到。这些非特异峰不是模板相关峰，
也可能在阴性对照以及低浓度产物分析中出现。在扩增样品中，在蓝色（<70bp），
绿色 (<90bp)及黄色 (<95bp)均可观察到低于等位基因应答峰的杂峰出现，在等
位基因阶梯中，也可观察到低水平假峰；最显著的是出现在DYS389II 之上的一系
列峰。总而言之，与等位基因梯度峰相关的任何假峰的强度和位置并不影响对结
果的分析。另外，通过减少进样时间或上样体积可以降低它们的强度，或者将域
值提高到超出可见杂峰的水平。
DYS385a/b 协同
有关DYS385a/b 基因座的非协同性证明在先前已有所阐述。在 Kayser 最初发
表的引物序列中，在引物结合位点但在重复区以外引入了一个单碱基缺失
（11,13,21）。另外一套引物序列由Schneider(22) 发表，得到的扩增产物要小得
多并包含突变区。利用Kayser 引物扩增DYS385a/b 非编码区，比用Schneider 引
物得到的扩增产物少一个碱基。现在普遍使用的是Schneider 引物(13) 。
PowerPlex ®Y 系统使用Schneider 引物结合位点以得到更高的男性特异性，产
生的扩增产物与Kayser 位点相比要小得多。协同/有效性验证由U.S. National
Instituteof Standards and Technology (NIST)Standard Reference Material (SRM)
2395 HumanY-Chromosome DNA ProfilingStandard (Gaithersburg, MD) 完成。
VII. 问题及解决方案
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第 48 页
对于此处没有提及的问题，请联系您当地的Promega分公司（办事处）或代理
商。联系信息请登陆：www.promega.com，E-mail：Chinatech@promega.com。
问题 原因 评论及推荐的解决措施
等位基因缺失或峰值过低 DNA模板不纯 模板用量过少，这个原因非常罕见。
由于提取程序及样本来源的差异，
DNA样本中可能存在抑制物。
模板量不足 请使用推荐量的模板DNA。
模板量不足 在毛细管电泳分析时，可以通过减少
进样量，进行低拷贝数量分
（ Low-copy-number ，LCN），以
减少竞争性带电粒子的干扰。这可通
过进行扩增后纯化或除盐、使用低导
电率的甲酰胺、减少LS600的用量的
方法达到。这些方法需要通过实验室
内的认证。
酶活性不足 使用推荐量的AmpliTaq Gold ®DNA
聚合酶，查看试管上标注的保存期
限。
扩增程序不正确 确认扩增程序的设置
盐浓度过高或PH值改变 如果DNA模板保存在TE缓冲液中或
过高浓度的EDTA溶液中，则DNA模
板溶液的体积不可超过总反应液体
积的20％。DNA样本含有过多的K+,
Na+, Mg2+或EDTA，会抑制PCR反
应。PH值的改变，也会影响PCR反
应。建议将DNA保存在TE-4缓冲液中
（10mMTris-HCL，0.1mM）
热循环仪，平板或试管问题 在章节IV.B可查阅测试过其他品牌
的反应管、反应板及热循环仪。必要
的话，需校正热循环仪的加热模块。
引物浓度过低 使用推荐量的引物浓度。使用前，须
将10×PowerPlex ®16引物混合物在
漩涡振荡器上混匀15秒。
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毛细管电泳进样差（内标
重新进样。检查注射器是否泄漏，检
在一个或多个通道有额外的
杂峰出现
ILS600同样受到影响）
查激光源。
使用的甲酰胺质量差 当电泳时，应使用Hi-Di™甲酰胺。
混有另外一种模板DNA，
或者存在先前的扩增产物
可能存在交叉污染。应使用防回吸加
样头，并且及时更换手套。
样本变性不完全 将样本按照推荐的时间充分变性，并
且迅速置于碎冰上冷却，然后及时上
样电泳。
STR扩增的非特异峰 STR系统的PCR扩增通常会产生一
些比等位基因短一个重复序列的、微
弱的非特异峰。如果过量上样，会产
生较高的“阴影带”。 在章节VI.H中科
获得更多关于阴影带和非特异性扩
增的信息。
背景信号高 减少上样量或减少进样时间。（章节
V）
毛细管电泳（CE）相
关的非特异产物（尖
刺峰）
微小的电压变化或尿素结晶通过激
光光源时会导致“尖刺峰”或意外峰。
尖刺峰有时只在一种颜色内出现，但
通常会在多个颜色内出现，这样会容
易鉴别。如果出现可疑的尖刺峰，需
重新电泳确认。
CE相关的非特异产物
（污染物）
用于仪器的水或用于稀释10×遗传
分析缓冲液的水如果存在污染，会在
蓝色和绿色荧光中产生非特异峰。使
用高压灭菌水，更换小管，清洗缓冲
液容器。
DNA过量 扩增时男性DNA模板量超过2ng，会
引起大量阴影带的产生。可以减少模
板量或者是扩增循环数减少2-4个
（循环数为10/20或者10/18）。
拉升或渗透 当峰值过高或者应用于样本的
Matrix不正确或质量不高时，就会产
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生拉升现象。
•如果是ABI PRISM ®310 遗传分析
仪或377DNA测序仪，需要生成一个
新的Matrix 然后将其用于样本。如
果是ABI PRISM
®
3100 和
3100-Avant 型遗传分析仪或
AppliedBiosystems3100和3100xl型
遗传分析仪，需要进行一次新的光谱
校正，然后将样本重新电泳。
•不同仪器的灵敏度存在差异，需要
优化进样及凝胶上样的条件。请参阅
章节V。
等位基因Ladder与样本不
相同
长期存放于甲酰胺中的扩
使用新鲜的甲酰胺重新制备样品。
增样品会产生降解。
CE聚合胶 CE聚合胶超过保质期，或者将聚合
胶在室温放置时间超过一个星期。
仪器维护 按照用户使用手册推荐的操作，每天
或每周进行仪器的维护。
等位基因Ladder与引
物对混合物不匹配
应确保等位基因Ladder与引物对混
合物来自同一个试剂盒。
缓冲液不匹配 在样本稀释时使用了错误的缓冲液。
稀释样本时应使用 Gold
ST R1×Buffer★ 。
甲酰胺质量不高 当分析样本时，仅使用Hi-Di™甲酰
胺。
等位基因Ladder与样本是
否匹配
应确保等位基因Ladder与样本在同
一台仪器进行电泳。
毛细管电泳多次后，会发生
样本的轻度偏移
这可能由于多次电泳后，毛细管柱温
会发生改变。将等位基因Ladder和样
本重新同时电泳进行片段长度的检
测。
等位基因Ladder电泳质量
在每次电泳中可包含多个Ladder。
不佳
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峰高不平衡 DNA过量 如果扩增的模板量大1ng时，会引起
小基因座的产量远远高于大基因座，
即小基因座的优势扩增。减少模板
量，或将扩增程序中的循环数减少
2～4个循环（10/20或10/18循环），
可改善基因座间的峰高平衡。
使用 FTA ®卡纸 得到的结果与DNA过量时类似。将扩
增程序中的循环数减少2～4个循环
（10/20或10/18循环），可改善基因
座间的峰高平衡。
DNA样本降解 DNA样本降解，大基因座产量减少。
可将DNA重新纯化。
DNA模板量不足 使用推荐量的模板DNA。当扩增时模
板量过低，会产生随机效应。
反应混合物平衡问题 使用前应将 10×Primer Pair Mix 和
Gold ST R 10×Buffer★ 充分解冻，
并振荡混匀 15 秒， 振荡后
10×Primer Pair Mix 不要离心。定期
校准热循环仪及加样器。在某些情况
下，使用 59℃退火温度代替 60℃可
以改善平衡。
DNA模板不纯 案件现场的检材可能存在抑制物，会
导致位点丢失或峰高不平衡。
VII.B. GeneMapper ®ID 分析软件
问题 原因 评论及推荐的解决问题
等位基因未命名 GeneMapper ®ID 分析软件 当使用GeneMapper ®ID软件分析
样本时，分析参数和片段标准在分
析类型（analysis type）中必须全部
标注“Basic or Advanced”。如果他
们是不同的，就会产生错误信息
（Figure 10）。
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标注的ILS600片段数量不 确保ILS600至少有一个片段小于样
第 52 页
够 本的最小基因座，并且至少有一个
片段大于样本的最大基因座。
Ladder 外的等位基因座
（OL峰现象）
电泳时间过短，ILS的大一些
的片段未被仪器收集。
在电泳过程中，没有检测到全部的
已定义ILS600片段标准。
•使用样本中的内标标准片段创建新
的片段标准。
•延长电泳时间，重新电泳样本。
使用的等位基因Ladder 与
样本来源于不同的电泳过程
GeneMapper ®ID 软件要求
从样本的同一文件夹中导入
等位基Ladder。
使用同时电泳的等位基因Ladder重
新分析样本。
确保等位基因Ladder与样本在同一
文件夹中。新建一个Project程序，
并且重新分析。请参阅章节VI.B或
VI.C。
用于STR 系统的Panel文件
选择错误。
选择与扩增时使用STR系统相对应
的Panel文件。
等位基因Ladder 在样本类型一栏中，对于等位基因
Ladder没有标注为“Allelic Ladder”
在分析方法一栏选择了错误
的分析模式
没有正确的标注样本中的内
标片段
片段标准命名不正确(图12) 在章节VI.B中选择的部分区
域的数据起始点不确
在改进模式的片段标准中有
额外峰
电泳时间过短，ILS的大一些
的片段未被仪器收集。
确保使用“HID”分析模式
需对样本中的长度片段标准进行手
动定义。
在分析模式中调节数据起始点，或
者使用全片段分析。
打开片段匹配编辑器，点亮额外峰，
选择“编辑（Edit）”，然后点击“ 删
除片段标记（delete size label）”，
最后选择“ 自动调节片段（auto
adjust sizes）”。
在电泳过程中，没有检测到全部的
已定义ILS600片段标准。
•使用样本中的内标标准片段创建新
的片段标准。
• 延长电泳时间，重新电泳样本。
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片段标准中的峰丢失 峰值低于阈值 在分析方法设置中，降低红色荧光
通道的峰阈值。
错误信息“Either panel,
size standard, or analysis
method is invalid”
基因座未命名，但是没有显
示错误信息
某些内标峰质量差 直接对样本定义片段标准，跳过这
些峰。
片段标准与分析方法未在同
一模式下（ “Classic” 或
“Basic or Advanced”）
确保两个文件设置在同一个模式
下，要么“Classic”，要么“Basic or
Advanced”。
没有对样本选择Panel 在“Panel” 一栏中，选择与使用的
STR系统相同的Panel选项。
没有选择片段标准 在“片段标准”一栏中，确保选择了相
应的片段标准。
片段标准定义错误，或片段
峰丢失
重新定义片段标准，仅包含样本中
出现峰的区域。过早的中止电泳分
析或电泳时间过短都会引起Ladder
的大片段丢失。这些会在分析时的
片段质量处显示红色标记，并且将
不会对基因座进行名。
错误信息“Both the Bin Set
used in the Analysis
Method and the Panel
must belong to the same
指向分析方法的Bin设置被
删除
在 GeneMapper ®Manager 中选择
Analysis Method一栏，打开相应的
分析方法。选中Alleles一栏，选择
相应的Bin设置。
Chemistry Kit”
在分析方法的Alleles一栏中
选择了错误的Bin设置
确保选用了相应的Bin 设置，如
Figure 3所示。
基线明显升高 仪器相关 •ABI PRISM ®3100 、 3100-Avant
型遗传分析仪、Applied Biosystems
3130 和 3130xl 型遗传分析仪光谱
校正效果差。制作一个新的光谱校
正文件，然后重电泳样本。
•ABI PRISM ®310 型遗传分析仪的
Matrix 质量差。重新电泳，并优化
Matrix。
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分析方法使用Classic Mode 对样本使用 Classic 模式进行分析
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引起的基线噪音比在 Basic or
Advanced 模式下要高很多。我们推
荐分析方法和片段标准均在
Advanced 模式下。
在分析样本时，出现红色警
示，并且当数据显示时会出
现下面的错误信息“Some
selected sample(s) do not
在 ABI PRISM ®310 型遗传
分析仪上电泳样本时， 都没
有应用 Matrix，则无数据显
示。
contain analysis data.
Those sample(s) will not
be shown”
准备导入 Panel 和 Bin 文
件时，显示错误信息
不同的Panel和Bin设置发生
冲突。
“Unable to save panel data
java.SQLEException
ORA-00001: unique
constraint (IFA.CKP_NNN)
violated”
等位基因Ladder中的峰被
GeneMapper ®ID 软件 GeneMapper ®ID软件或微卫星分
使用GeneMapper ®ID软件分析数
据时需导入Matrix文件，并且重新进
行分析。
Panel和Bin设置全部删除，从另外
一种路径重新导入文件。
标记在Ladder范围以外
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第 55 页
析设置不能用来替代HID 分析设
置。GeneMapper®软件与
GeneMapper® ID软件使用的是不
同的运算法则，并且GeneMapper
®
软件无法使用等位基Ladder来纠正
片段长度的不同。Promega推荐使
用GeneMapper®ID软件来分析
PowerPlex®反应。如果使
GeneMapper®ID软件，版本3.1或
3.2，应确保分析方法选择为HID方
法。可以通过查看GeneMapper
®
Manager 中分析方法的General界
面确认这项设置。分析类型不能更
改。如果分析方法不是HID，必需将
其删除，然后重新创建一个分析方
法。
VII.C. PowerTyper
TM
16 Macro
问题 原因 评论及推荐的解决施
无法打开计算机中的文件 未安装Genotyper®软件 确保安装 Genotyper®2.5
（ Macintosh®） 或 Genotyper®3.6
（WindowsNT®）或更高版本的软件。
Genotyper ®软件版本不
正确
CD-ROM在运输中被损坏 请联系技术服务部门，E-mail ：
文件在下载或传输的过程
中被损坏
错误信息“Could not
complete the“Run
未识别到等位基因Ladder
文件
Macro”command because
no dye/lanes are selected”
未输入四种荧光颜色 对于Genotyper ®2.5、3.6或更高版本
PowerTyperTM 16 Macro 不能在
Genotyper ®2.5之前的版本中运行。
Chinatech@promega.com。
重新下载，或从CD-ROM上获得文件。
确保在含有等位基因Ladder混合物的
通道信息栏（sample info或color infor）
标明了ladder一词。Macro通过识别
ladder一词来确认样本文件中包含了
等位基因
Ladder。
的软件，在Edit下进行设置，优先输入
蓝、绿、黄、红四种颜色。
错误信息“Could not
complete the“Run
Macro”command because
等位基因Ladder中一个或
多个等位基因的峰值低于
150RFU
the labeled peak could not
be found”
Macro 误将等位基因
Ladder 样本中的 CE 尖刺
峰作为等位基因 Ladder
峰
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GeneScan ®分析参数中 将分析参数设定为“light smoothing”
第 56 页
等位基因Ladder的最小峰值高度被定
义为150RFU，如果低于此值，软件无
法识别及定位。需使用更多的样本量或
延长进样时间以确保等位基因Ladder
的峰值高于150RFU。
将等位基因Ladder重新上样电泳。
设定“heavy smoothing”
使得TH01 基因座9.3/10
不能分开
等位基因表格或图像中所
列数据不全
等位基因Ladder数据与使
用PowerTyperTM 文件不
确保PowerTyperTM Macro文件与使用
的等位基因Ladder相匹配。
匹配
等位基因阶梯中碱基对大
小与定义范围不符
确保内标定义正确。重新定义内标片
段， 然后使用GeneScan软件重新分
析样本。将等位基因阶梯中最小的等位
基因大小与在categories中列出的同
一等位基因碱基对大小及范围相比较。
如果需要，将category中的起始范围增
加6bp，然后以新名称保存Macro。
等位基因 Ladder 峰值过
高，使渗透杂峰被标记为
等位基因峰
缩短进样时间，减少Ladder用量，提
高参数中等位基因Ladder的域值，重
新分析样本。
Macro运行指令不正确 应使用POWER或POWER 20% Filter
的Macro选项。
未输入四种荧光颜色 对于Genotyper ®2.5、3.6或更高版本
Macro中的“Check ILS”无
图形显示
出现Ladder以外的峰 CE使用一段时间后，运行
了多个样本，不同样本的
迁移率会发生微小变化
由于内标定义错误，等位
基因大小不正确
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的软件，在Edit下进行设置，优先输入
蓝、绿、黄、红四种颜色。
对于Genotyper ®2.5、3.6或更高版本
的软件，在Edit下进行设置，优先输入
蓝、绿、黄、红四种颜色。
这也许由于温度或CE发生了变化。在
PowerTyperTM 16 Macro中，版本2.0，
在不同的时间进行Ladder的进样。使
用新的毛细管，不要将Ladder第一个
进样。
确保内标定义正确。使用 GeneScan
软件重新分析样本，然后重新定义内标
片段。
图12 在GeneMapper
®
ID软件中片段标准分布不正确的示意图
VIII. 参考文献（略）
IX. 附录
IX.A. STR分型优势
与AMP-FLP和VNTR等分型方法相比，STR基因分型方法所扩增的产物长度小
得多（小于500bp），因此更易于降解的DNA模板分析。此外，STR分型适用于多
种快速纯化方法所纯化的DNA，而这些纯化方法所获得的DNA量往往不够作
Southern印迹分析。
Promega的STR 产物具有不连续的可分离的长度，可以用每个基因座的几个或
所有等位基因的相同长度的片段构建成等位基因阶梯(Allelic Ladder)，肉眼观察或
利用仪器比对同一基因座的等位基因阶梯和扩增样品，可以快速和准确地确定等
位基因座。用PowerPlex ®Y系统获得的结果可以数据格式保存并与数据库做直接
比对。人口分析不需要使用随机确认的人口数据固定库。
IX.B. PowerPlex ®Y系统所含位点的优势
PowerPlex ®Y 系统所采用的基因座（Table 4 和 Table 5），具有很好的代表性并
被法医机构所认可。此多基因座系统包含了“European minimal haplotype”
（DYS19,DYS385a/b,DYS / ,DYS390,DYS392ⅠⅡ 和 DYS393）和 SWGDAM 推
荐的 Y-S TR 系统，此系统增加了除“European minimal haplotype”之外的 DYS438
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和 DYS439。登录 www.ystr.org 可获得 European minimal haplotype 的更多信息。
PowerPlex ®Y系统所包括的等位基因ladder包含了所观测的每一个基因座的最
常见的变异体。表5中列举了等位基因ladder的等位基因和男性DNA标准模板9948
的单模标本。
表4 PowerPlex ®Y系统的特异位点信息
STR位点 标记 染色体位置 GenBank ®号 重复序列1 5→3
DYS391 FL Yq G09613 TCTA(14)
DYS389 ⁄ⅠⅡ FL Yq AF140635 [TCTG][TCTA]
Complex(14)
DYS439 FL Yq AC002992 GATA(26)
DYS393 TMR Yq G09601 AGAT (14)
DYS390 TMR Yq AC011289 [TCTG][TCTA]
Complex (14)
DYS385a/b TMR Yq Z93950 GAAA (14)
DYS438 JOE Yq AC002531 TTTTC (26)
DYS437 JOE Yq AC002992 [TCTA][TCTG]
Complex (26)
DYS19 JOE Yq X77751 TAGA
Complex (14)
DYS392 JOE Yq G09867 TAT (14)
1
The August 1997 report (27,28) of the DNA Commission of the International Society for
Forensic Haemogenetics (ISFH) states, “1) for STR loci within coding genes, the coding
strand shall be used and the repeat sequence motif defined using the first possible
5´nucleotide of a repeat motif; and 2) for STR loci not associated with a coding gene, the
first database entry or original literature description shall be used”.
TMR = carboxy-tetramethylrhodamine
FL = fluorescein
JOE = 6-carboxy-4´,5´-dichloro-2´,7´-dimethoxyfluorescein
Table 5. PowerPlex ®Y系统等位基因Ladder信息
STR Locus Label Size Range of Repeat Numbers of Alleles Observed in
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AllelicLadder
Allelic
9948 Male DNA
Components1
LadderComponents
Positive Control2
(bases)
DYS391 FL 90–118 6, 8–13 10
DYS389I FL 148–168 10–15 13
DYS439 FL 203–231 8–153 12
DYS389II FL 256–296 24–34 31
DYS393 TMR 104–136 8–16 13
DYS390 TMR 191–227 18–27 24
DYS385 TMR 243–315 7–25 11,14
DYS438 JOE 101–121 8–12 11
DYS437 JOE 183–199 13–17 15
DYS19 JOE 232–268 10–19 14
DYS392 JOE 294–327 7–18 13
1
When using an internal lane standard, such as the Internal Lane Standard 600, the
calculated sizes of allelic ladder components may differ from those listed. This occurs
because different sequences in allelic ladder and ILS components may cause differences in
migration. The dye label also affects migration of alleles.
2
Information about the use of 9947A and 9948 DNA as standard DNA templates can be
found
in reference 29.
3
Follows the original nomenclature described by Ayub et al. (26).
我们成功的筛选了可以避免或者是减少非特异性扩增的引物，包括与其相关的
taqDNA聚合酶，例如重复单元的滑移和末端核苷酸的增加。重复单元的滑移，有
时被称作“n-4带”“阴影带”或“影子带”，这种滑移是由于DNA在复制过程中重复单元
的丢失，DNA在体内的变异，或者是这两者共同引起的。观察到的非特异性条带
的数量主要取决于位点以及DNA序列的复制。
末端核苷酸添加是由于Taq DNA聚合酶以不依赖于模板的方式在扩增的DNA片
段的3′末端加核苷酸，一般是腺苷酸，发生这一现象的频率取决于不同的引物序列。
因此有时能观察到比预计少一个碱基的假带（无末端添加）。将引物序列作了修
饰，并在扩增流程的最后一步，加入60℃延伸30分钟的步骤，可在推荐用量的DNA
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第 60 页
模板上作必要的完全的末端核苷酸添加。
存在微变化等基因座（基因座间相差的长度不是重复次数所致）使等位基因座
的解释和确认变得复杂。这和高度多态性，趋向微变化以及突变率的增加相关（35，
36）。
IX.C. DNA 的提取及定量
DNA IQTM System（Cat.# DC6700）是专门设计用于法医及亲子鉴定中 DNA 样本
的提取及定量。这项新技术使用磁性颗粒简便有效地制备来源于斑迹、血液、溶
液等用于 STR 分析的样本。使用 DNA IQTM System 树脂提取 DNA，可消除案件
样本中经常遇到的 PCR 抑制物及污染物。当模板量大时，使用 DNA IQTM System
可制备得到恒定量的 DNA。此系统可用于从常规样本，如口腔拭子、血液、FTA
®
纸上的斑迹中定量提取 DNA。此外，还可从组织、性犯罪案件检材及其它载体的
斑迹中提取 DNA，DNA IQTM System 的提取效果已通过使用 PowerPlex ®Y 检验
得到了证实。定购信息请参阅章节 IX.G。
开发的Plexor ®HY系统可用于人类DNA的定量，定购信息请参阅章节IX.G。
DNA IQTM System已经在Beckman Coulter Biomek®2000实验室，Biomek®3000
实验室的自动化工作平台Tecan Freedom EVO®液体处理器上得到应用（41）。除
此之外，还有用于Maxwell 16的DNA IQTM Reference Sample试剂盒和DNA IQ
TM
案例样品试剂盒。关于实验室自动工作站的信息可咨询Promega的当地分公司或
经销商：
（www.promega.com/worldwide/或 E-mail：Chinatech@promega.com）。
IX.D. 内标ILS600
内标（ILS）包含22个DNA片段，长度分别为60、80、100、120、140、160、
180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、
550及600碱基对。这些片段用CXR标记，可以在PowerPlex ®16扩增产物存在的
情况下，以第4种颜色进行单独检测。ILS 600与样本同时用于每一条泳道或每一
根毛细管，以提高应用PowerPlex ®16系统分析的精确度。ILS 600的配制及使用
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方法请参阅章节V。
注意：PowerPlex ®Y系统需要检测并标定ILS600的375碱基的峰值，目的是精确
标定所观察到的最大等位基因的大小
Figure 13. 内标 ILS600
IX.E. PowerPlex ®Y 系统扩增混合体系的制备
Table 6 提供了PCR扩增混合体系中各组分的用量。将单个反应的体积（μl）乘以
全部样本数，即可获得最终混合体系的总体积量（μl）。
PCR Master Mix
Component
Gold ST★R 10X
Volume Per
Reaction
2.5μl
× Number of
Reactions
×
= Final
Volume(μl)
=
Buffer
PowerPlex
®
Y 10X
2.5μl
×
=
Primer Pair Mix
AmpliTaq Gold ®
0.55μl (2.75u)
×
=
DNA polymerase1
nuclease-free water2 μl
Per tube
template DNA
Up to 19.45μl
×
×
×
=
=
=
volume2(0.25–1ng)
total reaction
25μl
volume
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1
假定AmpliTaq Gold ®DNA聚合酶浓度为5u/μl。若酶的浓度发生变化，所用的酶体积必须相应
地调整。
2
反应混合液体积加上模板 DNA 的体积应等于 25μl。考虑到模板 DNA 的体积，可以向反应混
合液中加入去核酸水，以使终反应体系到达 25μl。
IX.F. 缓冲液及溶液组分
10%过硫酸铵
将 0.05g 过硫酸铵溶于 500μl 去离了水中。
Blue Dextran上样缓冲液
88.25% 甲酰胺
15mg/ml Blue Dextran
4.1mM EDTA（PH8.0）
Gold ST★R 10X Buffer
500mM KCl
100mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C)
15mM MgCl2
1% Triton ®X-100
2mM each dNTP
1.6mg/ml BSA
TBE 10×缓冲液
107.8g Tris 碱
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7.44g EDTA (Na2EDTA·2H2O)
~55.0g 硼酸
将Tris 碱和EDTA溶于800ml灭菌水中，缓慢加入硼酸并监测溶液的PH至期望值
8.3，然后用灭菌水补足溶液终体积至 1 升。
TE-4 缓冲液（10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA [pH 8.0]）
2.21g Tris 碱
0.037g EDTA (Na2EDTA·2H2O)
将 Tris 碱和 EDTA 溶于 900ml 灭菌水中，用 HCl 调节 PH 至 8.0，然后用灭菌水
补足溶液终体积至 1 升。
IX.I. 相关产品
荧光 STR 复合系统
不用于医学诊断
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配套组分
*不用于医学诊断
**仅供实验室使用
样本制备产品
*不用于医学诊断
**仅供实验室使用
***仅供研究使用，不得用于诊断程序
聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂
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仅供实验室使用
ART ®Aerosol-Resistant Tips
(a) STR loci are the subject of U.S. Pat. No. RE 37,984, German Pat. No. DE 38
34 636 C2 and other patents issued to the Max-Planck-Gesellschaft zur
Förderung der Wissenschaften, e.V., Germany. The development and use of
STR loci are covered by U.S. Pat. No.5,364,759, Australian Pat. No. 670231
and other pending patents assigned to BaylorCollege of Medicine, Houston,
Texas. Patents for the foundational PCR process, European Pat. Nos.
201,184 and 200,362, expired on March 28, 2006. In the U.S., the patents
covering the foundational PCR processexpired on March 29, 2005.
(b) U.S. Pat. Nos. 6,238,863 and 6,767,703 and Korean Pat. No. 691195 have
been issued to Promega Corporation for materials and methods for
identifying and analyzing intermediate tandem repeat DNA markers. Other
patents are pending.
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(c) U.S. Pat. Nos. 5,843,660, 6,479,235, 6,221,598 and 7,008,771, Australian
Pat. No. 724531, Canadian Pat. No. 2,118,048, Korean Pat. No. 290332,
Singapore Pat. No. 57050 and Japanese Pat. No. 3602142 have been
issued to Promega Corporation for multiplex amplification of STR loci. Other
patents are pending.
(d) The purchase of this product does not convey a license to use AmpliTaq
Gold® DNA polymerase. You should purchase AmpliTaq Gold® DNA
polymerase licensed for the forensic and human identity field directly from
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registered trademarks of Applera Corporation. AmpliTaq Gold and GeneAmp
are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. ART is a registered
trademark of Molecular Bio-Products, Inc. Biomek is a registered trademark of
Beckman Coulter, Inc. Freedom EVO is a registered trademark of Tecan AG
Corporation. FTA is a registered trademark of Flinders Technologies, Pty, Ltd.,
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of Health and Human Services. Hi-Di and POP-4 are trademarks of Applera
Corporation. Liqui-Nox is a registered trademark of Alconox, Inc. Long Ranger
and Long Ranger Singel are registered trademarks of Cambrex Corporation.
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and Windows NT are registered trademarks of Microsoft Corporation. Nalgene is
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