promega A1360, A1380, A3600, A3610 Operating Instructions

pGEM®-T 和

®

pGEM

I. 描述……………………………………………………………………………………..

-T Easy 载体系统

原英文技术手册号码：TM042

产品 A1360，A1380，A3600 和 A3610 的操作指南。

所有技术资料均可在www.promega.com

请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本

网站上得到，

2

II. 载体图谱………………………………………………………………………………..
III. 产品组分……………………………………………………………………………..
IV. 采用 pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体和 2×快速连接缓冲液进行连接……….

A. 操作步骤…………………………………………………………………………

V. 采用 pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体的连接反应产物的转化………………...
VI. 注意事项…………………………….……………………………………………….

A. PCR 产物纯度…………………………………………………………………...
B. 平端 PCR 产物…………………………………………………………………
C. 优化插入片段与载体的摩尔比…………………………………………………
D. 有插入片段的转化子的筛选……………………………………………………
E. 实验对照………………………………………………………………………...

VII. 重组质粒 DNA 的提取…………………………………………………………….…
VIII. pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体单链 DNA 的制备….…………………………

IX. 疑难解答………………………………………………………………………………

X. 参考文献………………………………………………………………………………
XI. 附录 A：载体序列及限制性酶切位点………………………………………………

A. pGEM®-T 载体序列………………………………………………………………

B. pGEM®-T 载体限制性酶切位点…………………………………………………

C. pGEM®-T Easy 载体序列……………………………………………………….

D. pGEM®-T Easy 载体限制性酶切位点………………………………………….

XII. 附录 B：参考 资 料 …………………………………………………………………..

A. 缓冲液及溶液配方………………………………………………….…...………
B. 相关产品…..……….……………………………………………….…...………

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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3

6

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7

7

8

8

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11

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16

16

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21

21

22

I. 描述

EcoRⅤ酶切 pGEM
插入位点 3’-T 突出端可提高 PCR 产物的连接效率，因为 3’-T 突出端可以防止载体的自

pGEM

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体系统可用于 PCR 产物的克隆。这两种载体是通过

®

-5Zf(+)和 pGEM®-T Easy 载体，并在 3’末端加入胸腺嘧啶构建的。

身环化，并且为热稳定性聚合酶（1，2）产生 PCR 产物提供一个匹配碱基。如表 1 总结
的，这些聚合酶常常以不依赖模板方式在扩增产物的 3’端加上一个脱氧腺苷酸（3，4）。

®

pGEM

-T 和 pGEM®-T Easy 高拷贝数载体包含有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶启动子，

其侧翼和多克隆位点区相接，多克隆位点区位于 β 半乳糖苷酶的 α 肽编码区内。α 肽插
入失活允许在指示培养基用颜色直接筛选重组克隆。另外这两个载体的多克隆位点区的
限制性酶切位点适用于采用 Promega 公司 Erase-a-Base

®

系统（产品目录号#E5750）产

生一系列巢式缺失体。

®

pGEM

采用这些酶进行单酶切消化即可释放插入片段。如 pGEM
EcoRⅠ、BstZⅠ和 NotⅠ酶切位点。而 pGEM

-T 和 pGEM®-T Easy 载体的多克隆位点区含有一些这样的限制性酶切位点，

®

®

-T 载体多克隆区只有一种这样的酶切位

-T Easy 载体多克隆区的

点 BstZⅠ。这两种载体也可选用适当的双酶切消化释放插入片段。

®

pGEM

-T 和 pGEM®-T Easy 载体含有丝状噬菌体 f1 复制起始子，可用于制备单链

DNA (ssDNA 参见第Ⅶ部分)。单链 DNA 分子对应于图 1 底部一条链，图一中上图代表
pGEM®-T 载体，下图代表 pGEM®-T Easy 载体。

®

pGEM

-T 和 pGEM®-T Easy 载体系统包含 2×快速连接缓冲液，用于连接 PCR 产

物。采用这种缓冲液进行连接，在室温孵育 1 小时即可完成。延长孵育时间可增加转化
克隆菌数目。一般 4℃过夜连接可产生最多的转化子。

表 1. 部分热稳定性 DNA 聚合酶所产生的 PCR 产物特性的比较。

热稳定性 DNA 聚合酶

®

特性

PCR 产物末端

Taq/

AmpliTaq

®

3’A 3’A 3’A

Tfl Tth

Vent

(Tli)

>95%

平端

/

Deep

®

Vent

>95%

平端

Pfu Pwo

平端 平端

5’-3’外切酶活力 有 有 有 无 无 无 无
3’-5’外切酶活力 无 无 无 有 有 有 有

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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II. 载体图谱

A. pGEM

pGEM

®

®

-T 载体和 pGEM®-T Easy 载体多克隆位点序列

-T 载体

注意：用

BstZ I (Cat.#
R6881) 单酶切

可释放插入

®

pGEM

-T 载体

的 DNA 片段。

注意：用

BstZ I (Cat.#
R6881), EcoR I
(Cat.# R6o11)或
Not I (Cat.#
R6431) 进行单

酶切可释放插入

®

pGEM

-TEasy

载体的 DNA 片
段。

图 1. pGEM

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体的启动子及多克隆位点区序列 。上部序

列链对应于用 T7 RNA 聚合酶合成的 RNA 序列，底部序列链对应于用 SP6 RNA 聚合
酶合成的 RNA 序列。

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B. pGEM

®

-T 载体图和相关序列位点

可使用 SP6
Promoter Primer
(Cat.# Q5011),
T7 Promoter
Primer (Cat.#
Q5021),
pUC/M13
Forward Primer

（Cat.# Q5601）,
或 pUC/M13

Reverse Primer

（Cat.# Q5421）
对插入的 DNA 片
段进行测序。

注意：用 BstZ I

(Cat.# R6881)

单酶切可释放插

®

入 pGEM

-T 载体

的 DNA 片段。双
酶切也可用于释

®

放插入 pGEM

-T

载体的 DNA 片
段。

图 2. pGEM

pGEM

®

®

-T 载体相关的序列位点

T7 RNA 聚合酶转录起始位点
多克隆位点区 10－113

SP6 RNA 聚合酶启动子（－17 至＋3） 124－143
SP6 RNA 聚合酶转录起始位点
pUC/M13 反向测序引物结合位点 161－177

lacZ 起始密码子
lac 操纵子 185－201

β内酰胺酶编码区 1322－2182
噬菌体 f1 区 2365－2820

lac 操作子序列 2821－2981，151－380
pUC/M13 正向测序引物结合位点 2941－2957
T7 RNA 聚合酶启动子（－17 至＋3） 2984－3

-T 载体环形图谱及相关的序列位点

1

126

165

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C. pGEM®-T Easy 载体图和相关序列位点

可使用 SP6

Promoter Primer
(Cat.# Q5011),
T7 Promoter
Primer (Cat.#
Q5021),
pUC/M13
Forward Primer

（Cat.# Q5601）,
或 pUC/M13

Reverse Primer

（Cat.# Q5421）
对插入的 DNA 片
段进行测序。

图 3. pGEM®-T Easy 载体环形图谱及相关的序列位点

pGEM

®

-T Easy 载体相关的序列位点

T7 RNA 聚合酶转录起始位点
多克隆位点区 10－128

SP6 RNA 聚合酶启动子（－17 至＋3） 139－158
SP6 RNA 聚合酶转录起始位点
pUC/M13 反向测序引物结合位点 176－197
lacZ 起始密码子

1

141

180

注意：用 BstZ I

(Cat.# R6881)

单酶切可释放插

®

入 pGEM

-T 载

体的 DNA 片段。
双酶切也可用于
释放插入
pGEM®-T 载体
的 DNA 片段。

lac 操纵子 200－216
β内酰胺酶编码区 1337－2197
噬菌体 f1 区 2380－2835

lac 操作子序列 2836－2996, 166－395
pUC/M13 正向测序引物结合位点 2956－2972
T7 RNA 聚合酶启动子（－17 至＋3） 2999－3

pGEM

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体的特殊应用

1．PCR 产物的克隆。
2．采用 Erase-a-Base
3．单链 DNA 制备。

®

系统构建不定向巢式缺失体。

4．重组子的蓝白斑筛选。
5．利用双向启动子进行体外转录。（操作步骤详见 Promega 公司 Riboprobe

®

体外转录

技术手册＃TM016）。

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III．产品组成

产品 包装 目录号

®

pGEM

包括：

1.2µg pGEM
12µl 插入 DNA 对照（4ng/µl）
100 U T4 DNA 连接酶
200µl T

产品 包装 目录号

pGEM

-T 载体系统Ⅰ 20 个反应

®

-T 载体(50ng/µl)

DNA 连接酶的 2×快速连接缓冲液

4

1 操作手册

®

-T 载体系统Ⅱ 20 个反应

A3600

A3610

包括：

1.2µg pGEM

®

-T 载体(50ng/µl)

12µl 插入 DNA 对照（4ng/µl）
100 U T4 DNA 连接酶
200µl T

DNA 连接酶的 2×快速连接缓冲液

4

1.2ml JM109 高效率感受态细胞（6×200µl）
1 操作手册

产品 包装 目录号

pGEM

®

-T Easy 载体系统Ⅰ 20 个反应

A1360

包括：

®

1.2µg pGEM

-T Easy 载体(50ng/µl)

12µl 插入 DNA 对照（4ng/µl）
100 U T4 DNA 连接酶
200µl T

DNA 连接酶的 2×快速连接缓冲液

4

1 操作手册

产品 包装 目录号

pGEM

®

-T Easy 载体系统Ⅱ 20 个反应

A1380

包括：

®

1.2µg pGEM

-T Easy 载体(50ng/µl)

12µl 插入 DNA 对照（4ng/µl）
100 U T
200µl T

DNA 连接酶

4

DNA 连接酶的 2×快速连接缓冲液

4

1.2ml JM109 高效率感受态细胞（6×200µl）
1 操作手册

贮存条件：产品 A1360 和 A1380 中的感受态细胞保存在－70℃。所有其它组份可以
保存在－20℃或－70℃。

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
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IV．采用 pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体以及 2×快速连接缓冲液进行连接反应的步

骤

1． 短暂离心 pGEM

物汇集到管底。

2． 按以下方法建立连接反应。注意使用低 DNA 结合力的 0.5ml 离心管（如

VWR 目录号 20170－310）

3． 每次使用２×快速连接缓冲液时要充分混匀。

DNA 连接酶的 2×快速连接缓冲液

T

4

®

pGEM

-T 和 pGEM®-T Easy 载体（50ng）
PCR 产物
插入 DNA 对照 －
T

DNA 连接酶（3 Weiss 单位/µl）

4

补加去离子水至终体积

* PCR 产物:载体的摩尔比可能需要进行优化（见章节 VI.C）

4． 用移液器吹打连接反应使之混匀后，室温孵育 1 小时。
5． 如果需要得到最大数目的转化菌落，可选择 4℃孵育过夜。

注意：

1． 在使用 pGEM

Promega 公司 T
酶活力，造成载体的末端胸腺嘧啶被除去。

2． ２×快速连接缓冲液含有 ATP，在温度波动时 ATP 易降解。可将缓冲液分

装成一次用量的小管，这样可避免反复冻融及经常的温度变化。

3． 在每次使用２×快速连接缓冲液时一定要用混悬器混匀。

4． 长孵育时间可增加转化子的数目，一般 4℃孵育过夜可得到更多的转化子。

V．pGEM

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体连接反应产物的转化步骤

一定要使用高效率的感受态细胞（1×10
基突出端进行连接不是很有效，采用转化效率高的感受态细胞 1×10
更高）可得到合理的克隆菌数目（参见章节 VI. E）。

我们建议使用 JM109 高效感受态细胞（产品目录号：L2001），pGEM®-T 和

pGEM

®

-T Easy 载体系统Ⅱ提供这种感受态细胞。也可使用其他宿主菌，但是它们应该

适合用蓝白斑及氨苄进行筛选。

在使用 JM109 制备感受态细胞前，JM109 应保存在含加维生素 B1 的 M9 基本培
养基中，这有助于 F’因子的选择，F’因子带有 proAB 基因，这和脯氨酸营养缺陷型宿
主菌（proAB 基因缺失）是互补的，携带的 lacIqZΔM15 对于蓝白斑筛选是必需的。
如果你不采用 Promega 公司 JM109 高效率感受态细胞，应按照后面的转化步骤进行
操作。在 LB/氨苄/IPTG/X-Gal 平板筛选转化子（参见章节 XI. A），为得到理想的结果，
最好不要使用放置超过 1 个月的平板。

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体及 DNA 插入对照管，使内容

标准反应 阳性对照 背景对照

5µl 5µl 5µl
1µl 1µl 1µl
Xµl*

－ －
2µl

－

1µl 1µl 1µl
10µl 10µl 10µl

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体连接时只能使用本系统提供的
DNA 连接酶。其他商用的 T4 DNA 连接酶可能具有外切

4

8

cfu/µg DNA）进行转化，因为采用单碱

8

cfu/µg DNA（或

制备感受态细胞
所用的 JM109
应保存在含加维
生素 B1 的 M9
基本培养基中

JM109 的基因型是：recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rK–,mK+), relA1, supE44, △

( lac-proAB), [F´, traD36, proAB, laclqZ△M15] (5).

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办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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操作者需准备的材料（溶液配制参见章节 XII. A）

z LB 平板（含有氨苄/IPTG/X-Gal）
z SOC 培养基

在第 3 步，避免
反复吹打，因感受
态细胞特别脆弱。

1． 每个连接反应准备 2 个 LB/氨苄/IPTG/X-Gal 平板，附加 2 个平板测定转化效

率（见章节 VI.E），涂板前将平板平衡至室温（步骤 10）。

2． 离心使连接反应内容物汇集到管底，取 2μl 连接反应产物加到置于冰上的

1.5ml 离心管中（见注意事项 1），向另一置于冰上的 1.5ml 离心管加入 0.1ng
未酶切的质粒以测定感受态细胞的连接效率。（见章节 VI.E）

3． 将冻存的 JM109 高效率感受态细胞从－70℃冰箱中取出，放置在冰浴直至融

化（大概 5 分钟），轻轻振动离心管使之混匀。

4． 向步骤 2 准备的每个转化管中加入 50μl 感受态细胞。（加入 100μl 细胞进

行转化效率的测定）
5． 轻轻振动小管混匀，冰浴 20 分钟。
6． 在精确的 42℃水浴中热击 45－50 秒（不要振动）。
7． 迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却 2 分钟。
8． 每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的 950μl SOC 培养基，而转化未酶

切质粒的细胞加入 900μl SOC 培养基。（可加入 LB 培养基，但得到的克隆
菌数目可能会降低。）

9． 在 37℃振荡培养（150rpm）1.5 小时。
10． 将每个转化培养基 100μl 涂到两个 LB/氨苄/IPTG/X-Gal 平板上。对于

转化对照，建议涂板时用 SOC 培养基 1：10 稀释。如果期望得到更高的克隆
数目，可将细胞用 1000 x g 离心 10 分钟沉淀，然后用 200 μl SOC 培养
基重悬后，各取 100μl 涂 2 块板。

11． 将平板于 37℃过夜培养（16－24 小时）。我们的实验经验是：使用 1×

8

cfu/µg DNA 的感受态细胞，每个平板涂布 100μl，大约可得到 100 个克

10

隆。长时间孵育或将平板 37℃过夜培养后贮存在 4℃，有助于蓝白斑筛选。
白色克隆菌一般包括插入子，然而，蓝色克隆菌也有可能包括插入子，更多
信息请参看章节 VI.D。

注意：

1. 实验证明使用大的（17×100mm）聚丙烯管（比如 Facon 公司产品，目
录号：2059），可增加转化效率。实验时避免使用可结合 DNA 的管子，
因为其大大降低克隆菌数目。

2. 包含β-半乳糖苷酶活性的克隆菌相对于无该酶活性的菌而言，生长比较
慢。过夜培养后，一般蓝斑比白斑小，大约 1μm 直径大小。

VI．注意事项

A. PCR 产物的纯度

连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 反应产物。用于连接反应的 PCR 产物

可用 Wizard

®

SV Gel and PCR Clean-Up System

(d)

(Cat.# A9281)进行胶纯化或直接

进行 PCR 产物的纯化。 应尽量减少暴露在短波紫外灯的时间以避免嘧啶二聚体的形
成。如果电泳检测 PCR 产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，并
用 Wizard
只有预期大小的明显条带，也应使用 Wizard

®

SV Gel and PCR Clean-Up System 纯化 DNA。即使 PCR 产物电泳检测

®

SV Gel and PCR Clean-Up System 对

目的条带进行凝胶纯化或 PCR 产物直接纯化以除去引物二聚体。不经纯化的 PCR 产
物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和 PCR 产物中其它物质的影响，
造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的 PCR
产物的阳性克隆。

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B. 平端 PCR 产物

具有校正活性的热稳定性 DNA 聚合酶如 Pfu DNA 聚合酶 (产品目录号：M7741)，
Pwo DNA 聚合酶，Tli DNA 聚合酶（目录号 M7101）在进行 PCR 扩增时产生平端 PCR
产物。这种平端 PCR 产物可以通过加 A 尾程序后（图 4），连接到 pGEM

®

-T 和 pGEM®-T
Easy 载体中（6）。采用这种方法连接，只有一个片段插入，而平端连接克隆可能产生
多个插入。另外采用 T 载体克隆不需要对载体去磷酸化，载体自连的背景很低。

Pfu 和 Tli DNA 聚合酶产生的 PCR 产物经过加尾处理，并以理想载体：插入片段
比例进行连接，可得到 55－95％重组子（表 2）。值得注意的是，PCR 产物有必要采
用 Wizard

®

SV Gel and PCR Clean-Up System

化或凝胶纯化。若 PCR 产物不进行纯化，Pfu

(d)

(Cat.# A9281)进行 PCR 产物直接纯

、

Pwo 和 Tli DNA 聚合酶的校正活性在
进行加尾反应或连接反应时，可降解 PCR 片段的 3’-A 或除去加尾反应的载体的 3’-T
突出端。

为了提高克隆效率，应根据纯化 PCR 产物的摩尔浓度调整加尾反应中的 DNA 量
和连接需要的体积。当 PCR 产物片段小或扩增反应良好，产物的摩尔浓度高，加尾或
连接反应需要的体积很小。相反，如果 PCR 片段比较大或扩增不好，产物的摩尔浓度
低，则需要较大的体积。我们已成功地用 Ta q DNA 聚合酶 对 1-7µl 纯化的平端 PCR
片段进行加尾反应，并优化插入片段:载体的连接比例，参见章节 IV.C 详细讨论了插入
片段:载体比例的优化。转化后采用蓝白斑筛选重组子，结果 70－100％的重组子含有

PCR 扩增的 DNA 片段，而 PCR 片段没有加尾的对照反应，只有很少的重组子。对照

®

实验结果表明大多数 pGEM

-T Easy 载体含有 3’-T，并且 Taq DNA 聚合酶可成功对大

多数 PCR 片段加上 3’-A。

表 2. 用于不同 DNA 聚合酶的加 A 尾程序的比较

％重组子1

聚合酶

Pfu DNA 聚合酶
Tli DNA 聚合酶

将 Pfu 和 Tli DNA 聚合酶产生的 PCR 产物加 A 尾后和 pGEM®-T Easy 载体进行连接，连接条件是 24
℃连接 1 小时或 4℃连接 16 小时。将 2µl 连接反应物转化 JM109 感受态细胞，涂布在 LB/氨苄

/IPTG/X-gal 平板上。

1

％重组子=白色克隆菌数/白色和蓝色克隆菌数×100％。PCR 产物加 A 尾前经过 Wizard® PCR

Preps DNA 纯化系统

2

检测的插入片段:载体连接比例为 5:1，3:1，1:1。用于加 A 尾反应的 PCR 扩增产物的体积为 1-2µl。

3

检测的插入片段:载体连接比例为 3:1，2:1，1:1。用于加 A 尾反应的 PCR 扩增产物的体积为 3-7µl。

4

检测的插入片段:载体连接比例为 3:1，2:1，1:1。用于加 A 尾反应的 PCR 扩增产物的体积为 1-2µl。

5

检测的插入片段:载体连接比例为 2:1，1:1。用于加 A 尾反应的 PCR 扩增产物的体积为 4-7µl。

(f)

纯化。

24℃连接 1 小时

（标准方法）

542bp 1.8kb 542bp 1.8kb

65-84%
68-77%

2

31-55%3 81-95%2 50-75%3

4

37-65%5 85-93%4 60-81%5

4℃连接 16 小时

（可供选择的方法）

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由具有校正活性的 DNA 聚合酶（如 Pfu DNA 聚合酶）产生的

PCR 扩增片段的纯化产物 1-7µl

注意：对同样的插
入片段，若使用插
入片段:载体摩尔
比为 1:1，需要

0.5kb 的插入片
段 8.3ng。

加入 1µl Taq DNA 聚合酶 10×反应缓冲液（含 MgCl

2

）

加入 dATP 至终浓度 0.2mM。

加入 5 单位的 Taq DNA 聚合酶

加去离子水至终反应体积为 10µl

70℃孵育 15-30 分钟

采用 1-2µl 用于 Promega 公司 pGEM

图 4. 用于 T-载体克隆的平端 PCR 产物经过 Wizard

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体连接反应

®

SV Gel and PCR Clean-Up

System (Cat.# A9281) 纯化后加 A 尾实验步骤。

C．优化插入片段和载体的摩尔比

pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体系统优化的插入 DNA 对照片段和载体的摩

尔比为 1:1，采 用 8:1 到 1:8 的连接比例也可成功进行连接。如果你的 PCR 产物开
始的连接不理想，则有必要优化连接比例。一般开始采用 3:1 到 1:3 的连接比例。

PCR 产物的浓度可通过凝胶电泳上的 DNA 分子量标准进行估计或采用荧光定量。
pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体大概 3kb 大小，系统提供的载体浓度为 50ng/µl。

计算连接反应中需要的 PCR 产物的量可采用以下公式。

加入载体的量（ng）×插入片段大小（kb）

载体大小（kb）]

×插入片段和载体的摩尔比=插入片段的量（ng）

根据推荐的不同插入片段:载体比例加入足够的 pGEM

®

-T 和 pGEM®-T Easy

载体进行连接，并进行对照反应。

举例说明插入片段和载体比例计算：

假如插入片段和载体的连接比例为 3:1，如连接反应中加入 3kb 载体 50ng，

问 0.5kb PCR 产物需加入多少？

50ng载体×0.5kb插入片段

3.0kb载体

×3/1 =25ng 插入片段

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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D．筛选含插入片段的转化子

插入片段成功克隆到 pGEM
的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。然而连接到 pGEM
和 pGEM

®

-T Easy 载体的 PCR 产物的特点对转化后蓝白斑克隆菌的比例影响很大。大

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体中，可阻断 β 半乳糖苷酶

®

-T

多数情况下含有 PCR 产物的克隆菌为白色，如果 PCR 片段和 LacZ 基因在同一读码框，
则重组克隆菌可能为蓝色。这种 DNA 片段碱基数是 3 的整数倍（含 3’-A），并且读码
框无终止密码子。据文献报道，在同一读码框内插入长达 2kb 的 DNA 片断，重组克隆
菌仍可能为蓝色。

即使 PCR 产物不是 3 的整数倍大小，由于扩增反应可引入突变（缺失或点突变），
也可造成 pGEM

pGEM
公司 pGEM

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体和片段连接转化后，重组克隆菌为蓝色。

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体系统的对照 DNA 为 542bp，来源于 Promega

（b,个g）

®

-luc

DNA (Cat.#E1541)，这个 DNA 序列被引入突变，在 6 个读码框

中含有多个终止密码子，从而确保对照反应产生的蓝色克隆菌的背景数很低。由此可见，
插入 DNA 对照的结果不能代表你的 PCR 产物的连接结果。

E. 实验对照

Promega 公司强烈推荐使用以下对照操作，这些对正确评价 pGEM

®

pGEM

-T Easy 载体系统是必要的。

®

-T 和

阳性对照

采用插入 DNA 对照建立连接反应（章节 IV），并按照第Ⅴ部分介绍的方法进行转
化。这种对照反应可确定是否能有效连接。一般当感受态细胞转化效率为 1×108 cfu/µg
DNA，可观察到大约 100 个菌落，其中 10－40％菌落为蓝色，超过 60％为白色。插
入的 DNA 对照是经过专门设计的，其插入可产生白斑，然而其它的 DNA 片段插入可
能不产生白斑（见章节 VI.D）。阳性对照连接产生的蓝斑背景来自无 T 尾及不完全消化
的 pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体。这些蓝斑也可看作一个内在的转化对照，如果转
化结果没有任何克隆菌，表明是转化本身有问题。如果只得到蓝斑，没有白斑产生，则
说明连接反应存在问题。如果阳性对照<50%菌落为白斑，表明连接条件可能不理想。

背景对照

按照第Ⅳ部分 A 方法建立连接反应，反应体系中只加入 50ng pGEM

®

pGEM
反应可确定由于无 T 尾及不完全消化的 pGEM

-T Easy 载体，不加入插入片段，并采用第Ⅴ部分介绍的方法进行转化。此对照

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体产生的蓝斑

背景。如果严格按照第Ⅴ部分的方法进行转化，感受态细胞效率为 1×10
一般可观察到 10－30 个蓝斑背景。（感受态效率为 1×10

9

－3 个 蓝斑；感受态效率 1×10

cfu/µg DNA 时，可观察到 100－300 个蓝斑）。采用

7

cfu/µg DNA 时，可观察到 1

8

cfu/µg DNA，

®

-T 和

标准方法连接 PCR 产物，将转化产生的蓝斑数目与背景对照相比，如果其蓝斑数明显
高于背景对照，表明这些蓝斑中有重组克隆菌（见章节 VI.D）。

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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转化对照

采用没有酶切的质粒（不是 pGEM

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体，因为这两个载体

已经线性化）进行转化以检测感受态细胞转化效率并以 cfu/µg DNA 进行计算。如转化
效率低于 1×10
见章节 XII.B.）。如果你不采用 pGEM

8

cfu/µg DNA，则需要重新制备感受态（Promega 公司有感受态细胞，

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体系统Ⅱ（目录号分别

是 A3610 和 A1380）中提供的高效率 JM109 感受态细胞，一定要注意使用的感受态
细胞适合蓝白斑及氨苄筛选，并且其转化效率至少为 108 cfu/µg DNA。

举例说明转化效率的计算：

用 100µl 感受态细胞转化 0.1ng 未酶切的质粒 DNA，转化反应后加入到 900µl SOC
培养基（0.1ng DNA/ml）。然后用 SOC 培养基 1:10 稀释（0.01ng DNA/ml），而后两
个平板分别涂布 100µl（0.001ng DNA/ml）。如果产生 200 个菌落（两个平板菌落的平
均数），转化效率是多少？

200 cfu/0.001ng = 2×10

5

cfu/ng = 2×108 cfu/µg

VII. 重组质粒 DNA 的提取

Promega 公司操作及应用指南（8）介绍的质粒小量提取步骤需要进行 30－60 分
钟，。这种质粒小量提取费时费力，特别是进行很多质粒的小量提取时。Wizard

(h, i)

SV 小量 DNA 纯化系统

VIII. pGEM

®

-T 和 pGEM®-T Easy 载体单链 DNA 的制备

为诱导单链DNA的产生，含有pGEM

(Cat.# A1330)是一种方便和可信赖的方法。

®

-T或pGEM®-T Easy 载体的细菌细胞需要用

®

Plus

适当的辅助噬菌体感染（例如R408辅助噬菌体，产品目录号：P2291）。质粒进入f1
复制模式，产生的单链DNA以包装病毒颗粒的形式输出。上清液经过简单的沉淀及抽
提步骤即可纯化单链DNA，详细过程参见操作及应用指南（目录号＃P1610）。如需更
多的信息，请联系附近的Promega公司办事处或代理商。在美国可联系技术热线1－
800－356－9526。

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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IX．疑难解答

问题 可能的原因 建议
无转化克隆菌产生 转化有问题或感受

态细胞没有活力。

插入 DNA 对照产生
不到 10％白色菌落

２×快速连接缓冲
液稀释不当

连接反应存在问题

T 突出端丢失，引起
载体平端连接，因
而蓝色菌落数高于

白色菌落数。
连接转化时产生大
量的克隆菌，但和插
入 DNA 对照相比，
白色菌落的比例低。

使用的感受态细胞

的转化效率很高

（ ≥1 × 109 cfu/µg

DNA），连接反应存

在问题。

不管有没有插入 DNA，因未酶切或无 T
尾载体自连产生的背景应有 10－30 个
蓝色菌落。建议检测背景对照（见章节
VI. E）

应用高效率感受态细胞（≥1 × 10

8

cfu/µg DNA ）。通过转化如
pGEM®-5Zf(+)等未切割的可用于抗性

筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效
率。按照第Ⅴ部分 A 的方法，使用 1×

8

10

cfu/µg DNA 感受态细胞可产生 100

个克隆菌，若使用 1×10

7

cfu/µg DNA

感受态细胞，则可能观察不到克隆菌
（见章节 VI. E）。

提供的 T4连接酶缓冲液为二倍浓度，10
μl 反应体积加 5μl T

连接酶缓冲液。

4

连接缓冲液只有低的活性。２×快速连
接缓冲液含有 ATP，温度波动 ATP 易
降解。使用一次性分装的缓冲液，避免
其反复冻化。

用大约 20ng DNA 分子量标准（如

Lambda DNA/Hind III 分子量标准，
Cat.# G1711）建立一个连接反应以检

测连接酶及缓冲液的活力。在凝胶上比
较连接的和未连接的 DNA 片段并检查
分子量标准 DNA 片段是否被连接成高
分子量的片段。

避免核酸外切酶的引入，降解 T 突出端。
只使用系统自己提供的 T

连接酶，这种

4

连接酶外切酶活力最低。

如果使用 1×109 cfu/µg DNA 的感受态
细胞，用试剂盒中的阳性对照进行连接
实验，大概可得到 1000 个克隆，其中
70－90％应为白色菌落。如连接反应没
有优化或失败，虽然转化的总克隆菌数
很高（≥1×10

9

cfu/µg DNA 感受态细胞

可获得高至 300 个菌落），但白色菌落
很少或没有。参见以上“连接反应失败”
中的建议对策。

对于没有表述的
问题，请联系当
地的 Promega
公司分支机构和
代理商（联系方
式可查看网站

www.promega.c
om ） E-mail ：
techserv@prom
ega.com

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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现象 可能原因 评论
采用插入 DNA
对照连接转化时
白色克隆菌数低
于 60％。

２×快速连接缓冲液稀
释不当。
T 突出端丢失，引起载体
平端连接，因而蓝色菌落
数高于白色菌落数。

连接温度太高。 连接温度过高（>28℃）可增加背景，

提供的 T
μl 反应体积加 5μl T

连接酶缓冲液为二倍浓度，10

4

连接酶缓冲液。

4

避免核酸外切酶的引入，降解 T 突出端。
只使用系统自己提供的 T

连接酶，这种

4

连接酶外切酶活力最低。

重组克隆菌减少。

PCR 产物连接
时白色菌落数
很少或根本没
有。

２×快速连接缓冲液稀
释不当。

连接孵育时间不够长。 连接过夜可得到理想结果。
PCR 产物中含有抑制连

接的成分，导致连接失
败。

PCR 产物不能连接，因
为其没有 3’-A 突出端。

提供的 T4连接酶缓冲液为二倍浓度，10
μl 反应体积加 5μl T

连接酶缓冲液。

4

将 PCR 产物和连接反应对照混合，观
察是否存在抑制效应。如怀疑有抑制成
分存在，应重新纯化 PCR 产物。

如表 1 所述，并非所有 DNA 聚合酶都
产生 3’-A 突出端（3，4）。平端 PCR
产物可采用适当的聚合酶及 dATP 进行
加尾反应产生 3’-A 突出端。

由于紫外灯过度照射形
成嘧啶二聚体，PCR 产物
不能连接。

凝胶纯化的 DNA 常出现这样的问题，没
有任何办法可以解决，DNA 需重新制备。
注意暴露在紫外灯下的时间应尽量缩短。
在凝胶和紫外灯之间使用玻璃板可降低
紫外灯的过度照射。如果可能，尽量使用

PCR 产物已经插入，但未
破坏 lacZ 基因。

长波长紫外光源观察 PCR 产物。

如果和背景对照相比有很多蓝色菌落，
这些蓝色菌落可能含有插入片段。蓝色
和白色菌落均可用于筛选（参见章节

VI.C）
插入片段：载体连接比例
不理想。

连接的 PCR 片段中可能
有引物二聚体。

凝胶电泳检测 PCR 产物的完整性及浓
度，优化插入片段：载体比例（参见章节

VI.C）。

®

引物二聚体可连接到 pGEM

®

pGEM

-T Easy 载体中，因为它们很小，

-T 或

所以酶切消化后电泳检测看不到带，看起
来载体中没有插入。和背景对照相比，连
接产生较多蓝色克隆。PCR 产物需要重

新凝胶纯化。
PCR 反应扩增的多种产
物克隆到 pGEM

®

pGEM

-T Easy 载体中。

®

-T 或

DNA 重排。 检测大量克隆观察重排是否是随机的。如

凝胶纯化目的条带。

果是随机重排，通过筛选可得到有目的

DNA 片段的克隆菌，而如果所有克隆是

一种重排方式，则需要使用修补缺陷的菌

株保护插入片段，减少重排事件的发生。

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办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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PCR 连接反应
只产生白色克隆
（没有蓝色克
隆）。

氨苄失活，因而氨苄敏感
菌可生长。
菌株（如 JM109）丧 失 F’
因子。

检查氨苄平板是正常制备并在一个月内
使用。
检测背景对照，如果菌落不是蓝色的，则
可能是宿主菌细胞丢失 F’ 因子（假设
lacIqZ∆M15 位于宿主菌的 F’因子上，并
使用正常平板）。用于 T-载体系统的感受
态细胞一定要正确制备。（参看章节Ⅴ）。

平板不适合蓝白斑筛选。 检测背景对照，如果克隆菌不是蓝色的，

检查平板是否含有氨苄/IPTG/X-Gal 以及
是否新鲜。如平板有问题，重新制备新鲜

平板。
含有目的 PCR
产物的克隆菌数
不够。

PCR 片段很多没有 A 尾。 将 PCR 产物纯化后进行加尾反应（9，

10）。样品纯化后进行连接反应。

插入片段：载体比例不理
想。

凝胶电泳检测 PCR 产物的完整性及产
量，优化插入片段：载体比例（参见章
节 VI.C）。

多个 PCR 产物被克隆进

®

pGEM

-T 或 pGEM®-T

凝胶纯化目的 PCR 产物。

Easy 载体

X． 参考文献

1. Mezei, L.M. and Storts, D.R. (1994) Purification of PCR products. In: PCR
Technology: Current Innovations, Griffin, H.G. and Griffin, A.M., eds., CRC Press,
Boca Raton, FL, 21.

2. Robles, J. and Doers, M. (1994) pGEM
Promega Notes 45, 19.

3. Clark, J.M. (1988) Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by
prokaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucl. Acids Res. 16, 9677.

4. Newton, C.R. and Graham, A. (1994) In: PCR, BIOSScientific Publishers, Ltd.,
Oxford, UK, 13.

5. Knoche, K. and Kephart, D. (1999) Cloning blunt-end PfuDNA
Polymerase-generated PCR fragments into pGEM
Notes 71, 10.

6. Haff, L. and Mezei, L. (1989) Amplifications1, 8.

7. Messing, J. et al. (1981) A system for shotgun DNA sequencing. Nucl. Acids Res. 9,

309.

8. Protocols and Applications Guide, Third Edition (1996) Promega Corporation.

9. Kobs, G. (1995) pGEM
Promega Notes 55, 28.
Zhou, M.-Y., Clark, S.E. and Gomez-Sanchez, C.E. (1995) Universal cloning

method by TA strategy. BioTechniques 19, 34.

®

-T Vector: cloning of modified blunt-ended DNA fragments.

®

-T Vector Systems troubleshooting guide.

®

-T Vector Systems. Promega

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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XI．附录 A：载体序列及限制性酶切位点

A． pGEM

下面列出的序列是环状载体 pGEM
列 51 位(星号指示的地方)采用 EcoRV 酶切线性化并在两个 3’末端添加 T 形成的。添
加的 T 没有包括在这个序列中。显示的序列和 T7 RNA Polymerase 合成的 RNA 序列
是一致的，而和 SP6 RNA Polymerase 合成的 RNA 序列是互补的。显示的这条链和载

®

-T 载体序列

®

-5Zf(+)的序列。pGEM®-T 载体是通过在该序

体产生的单链 DNA 是互补的。载体的序列也可在网站www.promega.com/vectors/上查
询。

1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC CGGCCGCCAT GGCCGCGGGA
51 T*ATCACTAGT GCGGCCGCCT GCAGGTCGAC CATATGGGAG AGCTCCCAAC
101 GCGTTGGATG CATAGCTTGA GTATTCTATA GTGTCACCTA AATAGCTTGG
151 CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA
201 ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC
251 CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT
301 TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC
351 GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC
401 TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT
451 CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG
501 AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC
551 GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA
601 ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC
651 CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT
701 GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC
751 TTTCTCATAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC
801 TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC
851 CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT
901 CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA
951 GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG
1001 AAGAACAGTA TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA
1051 AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT
1101 GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA
1151 AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA
1201 ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC
1251 TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA
1301 TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA
1351 TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC
1401 GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC
1451 AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA
1501 ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC
1551 GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC
1601 GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG
1651 TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA
1701 TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC
1751 CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC
1801 TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA
1851 AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA
1901 GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA
1951 CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT
2001 TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT
2051 GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA
2101 GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA
2151 ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA
2201 TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG
2251 AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA
2301 AAAGTGCCAC CTGATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC GTAAGGAGAA
2351 AATACCGCAT CAGGAAATTG TAAGCGTTAA TATTTTGTTA AAATTCGCGT
2401 TAAATTTTTG TTAAATCAGC TCATTTTTTA ACCAATAGGC CGAAATCGGC
2451 AAAATCCCTT ATAAATCAAA AGAATAGACC GAGATAGGGT TGAGTGTTGT
2501 TCCAGTTTGG AACAAGAGTC CACTATTAAA GAACGTGGAC TCCAACGTCA
2551 AAGGGCGAAA AACCGTCTAT CAGGGCGATG GCCCACTACG TGAACCATCA

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
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2601 CCCTAATCAA GTTTTTTGGG GTCGAGGTGC CGTAAAGCAC TAAATCGGAA

第 16 页 共 23页

2651 CCCTAAAGGG AGCCCCCGAT TTAGAGCTTG ACGGGGAAAG CCGGCGAACG
2701 TGGCGAGAAA GGAAGGGAAG AAAGCGAAAG GAGCGGGCGC TAGGGCGCTG
2751 GCAAGTGTAG CGGTCACGCT GCGCGTAACC ACCACACCCG CCGCGCTTAA
2801 TGCGCCGCTA CAGGGCGCGT CCATTCGCCA TTCAGGCTGC GCAACTGTTG
2851 GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT ATTACGCCAG CTGGCGAAAG
2901 GGGGATGTGC TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG GTTTTCCCAG
2951 TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA

B. pGEM

®

-T 载体限制性酶切位点

下列限制性酶切位点图表是基于环状载体 pGEM

®

-5Zf(+)的序列。pGEM®-T 载体

是通过在 51 位碱基采用 EcoRV 酶切线性化并在两个 3’末端添加 T 形成的。这个酶切
位点在载体和插入片段连接后不再存在。这个表格是通过 DNASTAR®序列分析软件产
生的。请注意我们没有用每一个酶进行消化来验证这个结果，给出的位点是酶切 DNA
的 3’末端的位置（酶切位点左侧的碱基）。如你发现有不确切的地方，请联系当地的
Promega 分支机构和代理商。

表 3. 在 pGEM

®

-T 载体上有 1－5 个切点的限制性内切酶。

注意：粗体字所列的酶可从 Promega 购买

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
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表 4. 不能切割 pGEM

®

-T 载体的限制性内切酶

注意：粗体字所列的酶可从 Promega 公司购买

表 5. 切割 pGEM

注意：粗体字所列的酶可从 Promega 公司购买

C. pGEM

pGEM

®

®

化并在两个 3’末端添加 T 形成的。添加的 T 没有包括在这个序列中。显示的序列和 T7
RNA Polymerase 合成的 RNA 序列是一致的，而和 SP6 RNA Polymerase 合成的 RNA

序列是互补的。显示的这条链和载体产生的单链 DNA 是互补的。载体的序列也可在网
站www.promega.com/vectors/上查询。

1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC CGGCCGCCAT GGCGGCCGCG
51 GGAATTCGAT* ATCACTAGTG AATTCGCGGC CGCCTGCAGG TCGACCATAT
101 GGGAGAGCTC CCAACGCGTT GGATGCATAG CTTGAGTATT CTATAGTGTC
151 ACCTAAATAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT
201 TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG
251 TAAAGCCTGG GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC
301 GCTCACTGCC CGCTTTCCAG TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA
351 TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT TTGCGTATTG GGCGCTCTTC
401 CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG
451 CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG
501 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA
551 CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG
601 ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA
651 GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC
701 TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT
751 CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG
801 GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA
851 GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG
901 TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC
951 AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA
1001 CTACGGCTAC ACTAGAAGAA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC
1051 CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC
1101 ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG
1151 AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG
1201 CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA

®

-T 载体 6 次以上的限制性内切酶

-T Easy 载体序列

-T Easy 载体是通过在该序列 60 位(星号指示的地方)采用 EcoRV 酶切线性

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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1251 AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATGAA GTTTTAAATC
1301 AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC CAATGCTTAA
1351 TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT
1401 GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC
1451 TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG
1501 ATTTATCAGC AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT
1551 CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGTT GCCGGGAAGC
1601 TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT GTTGCCATTG
1651 CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC
1701 TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA
1751 AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG
1801 CCGCAGTGTT ATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT
1851 GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT ACTCAACCAA
1901 GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT TGCCCGGCGT
1951 CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC
2001 ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT
2051 GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT
2101 CTTTTACTTT CACCAGCGTT TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT
2151 GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG AAATGTTGAA TACTCATACT
2201 CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT TGTCTCATGA
2251 GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG
2301 CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA
2351 GATGCGTAAG GAGAAAATAC CGCATCAGGA AATTGTAAGC GTTAATATTT
2401 TGTTAAAATT CGCGTTAAAT TTTTGTTAAA TCAGCTCATT TTTTAACCAA
2451 TAGGCCGAAA TCGGCAAAAT CCCTTATAAA TCAAAAGAAT AGACCGAGAT
2501 AGGGTTGAGT GTTGTTCCAG TTTGGAACAA GAGTCCACTA TTAAAGAACG
2551 TGGACTCCAA CGTCAAAGGG CGAAAAACCG TCTATCAGGG CGATGGCCCA
2601 CTACGTGAAC CATCACCCTA ATCAAGTTTT TTGGGGTCGA GGTGCCGTAA
2651 AGCACTAAAT CGGAACCCTA AAGGGAGCCC CCGATTTAGA GCTTGACGGG
2701 GAAAGCCGGC GAACGTGGCG AGAAAGGAAG GGAAGAAAGC GAAAGGAGCG
2751 GGCGCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC ACGCTGCGCG TAACCACCAC
2801 ACCCGCCGCG CTTAATGCGC CGCTACAGGG CGCGTCCATT CGCCATTCAG
2851 GCTGCGCAAC TGTTGGGAAG GGCGATCGGT GCGGGCCTCT TCGCTATTAC
2901 GCCAGCTGGC GAAAGGGGGA TGTGCTGCAA GGCGATTAAG TTGGGTAACG
2951 CCAGGGTTTT CCCAGTCACG ACGTTGTAAA ACGACGGCCA GTGAATTGTA
3001 ATACGACTCA CTATA

D. pGEM

pGEM

®

-T Easy 载体限制性酶切位点

®

-T Easy 载体是通过在 60 位碱基采用 EcoRV 酶切线性化并在两个 3’末端

添加 T 形成的。这个酶切位点在载体和插入片段连接后不再存在。这个表格是通过
DNASTAR®序列分析软件产生的。请注意我们没有用每一个酶进行消化来验证这个结

果，给出的位点是酶切 DNA 的 3’末端的位置（酶切位点左侧的碱基）。如你发现有不
确切的地方，请联系当地的 Promega 分支机构和代理商。在美国可拨打技术服务热线
1-800-356-9526。

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

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表 6. 切割 pGEM

®

-T Easy 载体 1 至 5 次的限制性内切酶

注意：粗体字所列的酶可从 Promega 公司购买

表 7. 不能切割 pGEM

注意：粗体字所列的酶可从 Promega 公司购买

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: [phone]；E-mail: [e-mail] 技术手册号码：CTM042

®

-T Easy 载体的限制性内切酶

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表 8. 切割 pGEM®-T Easy 载体 6 次以上的限制性内切酶

注意：粗体字所列的酶可从 Promega 公司购买

XII．附录 B：参考资料

A. 缓冲液及溶液配方

IPTG 母液（0.1M）

1.2g IPTG (目录号＃V3951)
补加水至终体积 50ml，过滤灭菌并贮存
在 4℃。

X-Gal (2ml)

100mg 5－溴－4－氯－3－吲哚－
β－D－半乳糖苷（产品目录号：V3941）
溶于 2 ml 二甲基甲酰胺。用铝箔封裹并
贮存在－20℃。

LB 培养基 （每升）

®

10g Bacto
5g Bacto

胰蛋白胨

®

酵母抽提物

5g NaCl

用 NaOH 调节 pH 至 7.0。

含氨苄的 LB 平板

加 15 克琼脂粉到 1 升 LB 培养基中。
高压灭菌。当培养基温度降至 50℃时，
加入氨苄至终浓度 100µg/ml。85mm 直
径的培养皿约需 30－35ml 培养基。培养
基完全凝结后，贮存在 4℃可使用 1 个月
或贮存在室温可使用 1 个星期。

含氨苄/IPTG/X-Gal 的 LB 平板

按以上程序制备氨苄平板时，补加
IPTG 和 X－gal 至终浓度为 0.5mM IPTG
和 80µg/ml X－gal，而后倒出培养基铺制
平板。另一种方法是在使用前将 100µl 的
100mM IPTG 和 20µl 的 50mg/ml X－gal
涂到氨苄平板的表面上，并在 37℃孵育
30 分钟使之吸收后使用。

SOC 培养基（100ml）

®

2.0g Bacto

0.5g Bacto

胰蛋白胨

®

酵母抽提物

1ml 1M NaCl

0.25ml 1M KCl
1ml 2M Mg2+母液，过滤灭菌（按

下法配制）

1ml 2M 葡萄糖，过滤灭菌

将 Bacto

®

胰蛋白胨、Bacto® 酵母抽提

物、NaCl 及 KCl 加到 97ml 的去离子水
中，搅拌使之溶解。高压灭菌并冷却到室
温。加入 2M Mg

2+

母液和 2M 葡萄糖至终
浓度 20mM。补加消毒蒸馏水至 100ml。
完全培养基用 0.2µm 的滤膜过滤灭菌。
最终 pH 值为 7.0。

2M Mg

＋

2

母液

20.33g MgCl

24.65g MgSO

· 6H2O

2

· 7H2O

4

加蒸馏水至 100ml，过滤灭菌。

２×快速连接缓冲液，T

DNA 连接酶（试

4

剂盒提供）

60mM Tris-HCl (pH7.8)
20mM MgCl

2

20mM DTT
2mM ATP
10% 聚乙烯乙二醇（MW8000，ACS

级）
分装为一次用量小管贮存在－20℃。避免
反复冻融。

TYP 肉汤（1 升）

®

16g Bacto
16g Bacto

胰蛋白胨

®

酵母抽提物

5g NaCl

2.5g K

HPO

2

4

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B. 相关产品

PCR 克隆系统

产品 包装 目录号

PT

ARGE-T

TM

Mammalian Expression Vector System

(a, l)

20 个反应

A1410

直接用 T 载体进行哺乳动物细胞表达

产品 包装 目录号

PinPoint
PinPoint

(a, b, m)

Cell

TM

Xa-1 T-Vector System

TM

Xa-1 T-Vector System II with Competent

(a, b, m)

20 个反应
20 个反应

V2610
V2850

直接用 T 载体进行细菌表达

热稳定性酶

产品 包装 目录号

PCR Master Mix

(n, o)

100 个反应

1000 个反应

M7501
M7502

预先混合包含 Taq DNA Polymerase, dNTPs, 反应缓冲液和鎂离子的 2x 溶液，然后很
简单地加入模板和引物。仅供实验试室使用。

产品 包装 目录号

GoTaqTM DNA Polymerase

(e)

(e, o)

100u M3001
500u M3005
100u M1661Taq DNA Polymerase
500u M1665

Pfu DNA Polymerase

(e)

（中国市场没有销售）

100u M7741
500u M7745

Tli DNA Polymerase 50u M7101

仅供实验试室使用。

RT-PCR 系统

产品 包装 目录号

Access RT-PCR System

AccessQuickTM RT-PCR System

Improm-IITM Reverse Transcription System

(n)

20 个反应
100 个反应
500 个反应

(n, p)

100 个反应
500 个反应

20 个反应
100 个反应

A1260
A1250
A1280
A1702
A1703
A1701
A3800

仅供实验试室使用。

PCR 产物纯化系统

产品 包装 目录号

Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System

(d)

50 个反应
250 个反应

A9281
A9282

仅供实验试室使用。

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
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产品 包装 目录号

Wizard® SV 96 PCR Clean-Up System

Wizard® MagneSilTM PCR Clean-Up System

(q)

4x96 个反应
8x96 个反应
1x96 个反应
8x96 个反应

100x96 个反应

4x96 个反应

A9341
A9342
A9340
A1931
A1935
A1930

仅供实验试室使用。

dNTPs

产品 包装 目录号

PCR Nucleotide Mix, （每种组分浓度为 10mM）

200µl C1141

1000µl C1145

dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 每种组分浓度为 100mM 每种 10µmoles
dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 每种组分浓度为 100mM 每种 40µmoles
dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 每种组分浓度为 100mM 每种 200µmoles

U1330
U1240
U1410

测序引物

产品 包装 目录号

SP6 Promoter Primer 2µg Q5011
T7 Promoter Primer 2µg Q5021
pUC/M13 Primer, Forward (24mer) 2µg Q5601
pUC/M13 Primer, Reverse (22mer) 2µg Q5421

注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
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