PCR D7233 User Manual
PCR Kit with Taq
产品编号 产品名称 包装
D7233 PCR Kit with Taq 2000 次
产品简介：
¾ 本PCR试剂盒带有Taq DNA Polymerase、PCR buffer、dNTP和上样缓冲液，自备模板和引物即可进行PCR反应，适合用于
普通的PCR或RT-PCR定性或定量检测，也可以用于不太长的的DNA片断的克隆。
¾ Taq DNA Polymerase简称Taq酶或Taq，是最常用的DNA聚合酶之一。
¾ Taq DNA Polymerase是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶，95℃孵育时的半衰期大于40分
钟。Taq酶的分子量为94 kDa。Taq酶可以催化5’至3’方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合。Taq酶没有3’至5’的外
切酶活性，有非常低的5’至3’外切酶活性。由于Taq酶没有3’至5’的外切酶活性，因此在DNA聚合过程中相当于核苷酸转
移酶的作用，最终会导致PCR产物的3’末端会产生3’-dA overhangs，即产生带一个A的3’粘端。本Taq DNA Polymerase为
recombinant Taq DNA Polymerase，通过大肠杆菌表达纯化获得，和纯化获得的天然Taq DNA Polymerase在各方面的性质
相同。
¾ 活性定义：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a polynucleotide fraction
(adsorbed on DE-81) in 30 min at 70
6.7 mM MgCl
dNTP, 0.4 MBq/ml [
¾ 纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，满足常规PCR反应要求。
¾ 酶储存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5% (v/v) Tween 20
and 50% (v/v) glycerol。
¾ 10×PCR Buffer (with Mg
¾ 失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Taq酶失活，加入脱氧胆酸钠至0.06%，SDS至0.01%，或sarkosyl至0.02%均可以抑制Taq
酶。
¾ 试剂盒带有dNTP，该dNTP为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物，每种的浓度均为2.5mM。
¾ 本试剂盒用于50微升的PCR反应体系，足够用于800个反应，用于20微升的PCR反应体系，足够用于2000个反应。
, 1 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each
2
3
H]dTTP。
2+
)：100 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 500 mM KCl, 15mM MgCl2, 0.8% (v/v) Nonidet P40。
℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 67 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃),
包装清单：
产品编号 产品名称 包装
D7233-1 Taq DNA Polymerase (5U/µl) 1000U
D7233-2 10×PCR Buffer (with Mg2+) 1ml×4
D7233-3 dNTP (2.5mM each) 0.8ml×4
D7233-4 6×DNA Loading Buffer 1ml×2
－ 说明书 1份
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
¾ 由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量
考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。
¾ Taq DNA polymerase在PCR过程中每循环的出错几率约为2.2x10
的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。对于普通的PCR或RT-PCR定性检测或定量检
测，Taq DNA polymerase是最佳选择。
¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
-5
，对于大于1kb的DNA片断的克隆推荐使用出错几率更低
使用说明：
1. PCR反应体系的设置：
a.
溶解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将Taq DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒内。
b. 参考下表在冰浴上设置PCR反应(如果有多个类似的PCR反应，可以先配制大体积的包含水、buffer、dNTP和Taq酶的
混合物，然后分装到各PCR反应管内。根据情况，有时混合物中可以包括引物)：
试剂 最终浓度
双蒸水或MilliQ水 - (36.75-x)µl (14.7-y)µl
10×PCR Buffer (with Mg2+) 1× 5µl 2µl
dNTP (2.5mM each) 0.2mM each 4µl 1.6µl
模板DNA 10pg-1µg* xµl yµl
引物混合物(10µM each) 0.8µM 4µl 1.6µl
Taq DNA Polymerase (5U/µl) 1.25U/50µl 0.25µl 0.1µl
总体积 - 50µl 20µl
*对于不同类型的模板在50µl反应体积中推荐用量如下：
哺乳动物基因组DNA：0.1-1µg；大肠杆菌基因组DNA：10-100ng；质粒DNA：0.1-10ng。
过多的模板DNA容易导致非特异性的PCR产物。
c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vor tex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
d. 如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油(mineral oil，ST275)。
e. 各设置好的PCR反应管置于PCR仪上，开始PCR反应。
2. PCR反应参数的设置可以参考如下示例：
STEP1(起始变性): 94℃ 3min
STEP2(变性): 94℃ 30sec
STEP3(退火): 55℃ 30sec
STEP4(延伸): 72℃ 1min
STEP5(循环): Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6(最终延伸): 72℃ 10min
STEP6(临时保存): 4℃ forever
a. PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件包括温度、时
间和循环数等。
b. STEP4(延伸)的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置，通常每kb产物的延伸时间为1分钟。例如PCR产物的长度
为1kb，则延伸时间可以设置为1分钟，PCR产物的长度为2kb，则延伸时间可以设置为2分钟，以此类推。
c. 对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。对于需进行半定量或定量
的PCR反应循环数一定要进行适当优化，使PCR反应没有达到平台期。
体积 体积
常见问题：
1. PCR产物非常少或没有特异性条带。
a. 引物设计不佳是PCR过程中最常见的问题。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结
构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的引物中，一定要注意加入酶切位点等后
整条引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在原有引物效果不佳的情况并且
阳性对照引物可以正常工作的情况下，可以考虑更换引物。
b. 待扩增片断GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时可以使用适合扩增高GC含量DNA片
断的GC-rich buffer，并相应地根据GC-rich buffer的要求或说明调整PCR反应参数的设置。
c. 长片断扩增。尽管Taq DNA polymerase可以扩增最长达8kb的DNA片断，但大多数时候比较适合扩增3kb以下的片
断，更长片断的扩增推荐使用其它更适合长片断扩增的DNA聚合酶。
d. PCR反应设置时在室温进行容易导致非特异性条件。推荐在冰浴上设置PCR反应。
e. 由于引物存在一定的二级结构或存在一定的引物二聚体，或引物偏短，导致退火效果不佳。此时可以采用Touch
down等方法进行退火，通常采用从65℃逐步缓慢降温到55或50℃的方法，使退火更加充分。
f. 退火温度不佳，需要优化。如果有温度梯度PCR仪，则可以设置退火的温度梯度，摸索退火的最佳温度。如果没有
温度梯度PCR仪，则可以通过多次PCR反应摸索最佳的退火温度。
g. 延伸时间不足。可按照每1kb片断延伸1分钟进行设置，对于较难扩增的片断可以设置为每1kb片断延伸1.5-2分钟。
h. 待扩增片断GC含量较高或长度较长，变性不够充分。可以调节起始变性条件至95℃ 1min甚至95℃
i. 在不同PCR仪上进行PCR反应，避免有时PCR仪出现问题。
j. 循环数不足，适当延长PCR的循环数。通常循环数最高不必超过40，常用的循环数范围为25-35。
k. 模板含量太低，适当加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即为在原先设计的PCR引物内
侧再设计一对PCR引物，然后对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，这样一方面可以起到扩增作用，
同时也可以从第一次PCR产物中扩增出特异性条带。二次PCR则为比较简单地用原有引物对第一次PCR产物进行稀
释后再进行一次PCR扩增，可以起到扩增作用，但不能去除非特异性条带。
l. 模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。
m. 当产生较多非特异性条带时，可以适当提高退火温度。
n. 注意设置适当的阳性对照和阴性对照通常会有很大帮助。
2-4min。
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