HopeYearr OSTEOMARK NTx Urine User Manual

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OSTEOMARK® NTx Urine

试剂盒说明书

酶联免疫吸附法(EIA)定量检测

人尿液中的 I 型胶原交联氨基末端肽(NTx)

仅供体外诊断用

Osteomark 的用途

Osteomark 用于定量测定分泌的交联型 І 型胶原 N 端肽
(NTx)。NTx 是骨吸收的一种标记物，尿液 NTx 水平的升高
标志着骨吸收水平的升高。NTx 的测量用于下列用途：
A． 预测绝经后妇女用激素抗吸收治疗的骨骼反应（骨密

度）。
B． 治疗监测：
1． 绝经后妇女的抗吸收治疗
2． 诊断为骨质疏松症人群的抗吸收治疗
3． 诊断为佩吉特骨病人群的抗吸收治疗
4． 激素遏制治疗
C． 验明补钙和用激素抗吸收治疗的绝经后妇女一年后骨密

度降低的相关性
Osteomark 的测量范围是 20~3000nM 骨胶原当量（BCE）。

摘要和试验解释

哺乳动物骨通过破骨细胞介导的骨吸收和随后由成骨细
胞介导的骨形成的连续过程，而不断地重塑，这个过程对骨
骼的正常发育和维持是必不可少的，这个紧密给合过程的异
常往往导致骨量和形状的改变。对特异的骨降解产物的测量，
可以为研究骨代谢率提供分析数据。

约 90%的骨组织基质是 І 型胶原，І 型胶原是一种分子 C
端和 N 端交联的螺旋蛋白，这种蛋白组成了骨组织的基本结
构和张力。

尿交联型 І 型胶原 N 端肽（NTx）的发现为骨吸收提供
了一种物异的生化标记物，这种标记物可以用免疫测定法分
析。NTx 分子对骨的专一性基于其氨基酸顺序的独特性和交

N 端肽的定位作用。NTx 分子的产生是由骨中破骨细

联的 α

2

胞介导的，作为一种稳定的降解终产物可存在于尿中。

Osteomark 用于定量测定分泌的 NTx。NTx 作为骨吸收

的一种标记物，尿液 NTx 水平的升高标志着骨吸收水平的升
高。临床研究表明，骨吸收水平升高是与年龄相关的骨降低
的首要原因，低骨量常常导致骨质减少，是骨质疏松症的主

1，2

要原因
道，骨质疏松性骨折是老年妇女发病率和死亡率升高的主要
因原

仅进行钙补充的绝经后妇女进行了一次随机、前瞻性的临床
试验。试验结果支持用 Osteomark 预测反应和监测抗吸收治

，当骨吸收水平高于骨形成水平时骨量降低。据报

3

。

对接受激素替代疗法（HRT）加钙补充（500mg/天），或

疗的效果

(Alendronate sodium,10mg)

了陈述。结果表明骨质疏松病人在经过三个月的治疗后
Osteomark 值应当被控制在≤35nMBCE/nM 肌酐或者与基准
线有 40%以上的改变.。

效果的能力，进行了一项研究。Osteomark 基线值和治疗开始
后与基线的变化百分率都与血清碱性磷酸酶总量有关。在正
常值层面上，Osteomark 在对抗吸收治疗的评估方面早于碱性
磷酸酶。抗吸收治疗三个月后，佩吉特病人 Osteomark 离基
准值应该有 30%以上的改变。

测定原理

（ELISA），它用吸附有 NTx 的微孔作固相，标本中的 NTx
和固相中的 NTx 竞争结合辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体
的结合点，结合到固相上的抗体的量和标本中的 NTx 量成反
比。标本中 NTx 的浓度用光度法定量测定，通过一个标准校
准曲线计算出来。稀释的尿液测定值用尿液肌酐分析校正，
用 nMBCE/mmol 肌酐/L 表示.。

试剂盒组成

试剂描述

PLATE

CONJ

4

。

Osteomark 监测抗吸收治疗的能力，在一项用双磷酸盐

5

治疗骨质疏松病人的研究中得到

为了测定Osteomark 在监测佩吉特骨病病人抗吸收治疗

Osteomark 测定是一种竞争抑制酶联免疫吸附测定

所供材料足够 96 人份用

使用介绍 1份

A

抗原包被的 96 孔板 12х8 孔条 1块

B

浓缩抗体结合液 0.4ml 管

C

抗体结合物稀释液 30 ml 瓶

D

30x 浓缩冲洗液 125 ml 瓶

E

显色剂 0.9 ml 瓶

F

缓冲液 30 ml 瓶

G

终止液 25 ml 瓶

1

1 nMBCE 标准品 0.4 ml 管

2

30 nMBCE 标准品 0.4ml 管

3

100 nMBCE 标准品 0.4 ml 管

4

300 nMBCE 标准品 0.4 ml 管

5

1000 nMBCE 标准品 0.4 ml 管

6

3000 nMBCE 标准品 0.4 ml 管

I

尿液质控品 I 0.4 ml 管

II

尿液质控品 II 0.4 ml 管
板封条 1包

96 孔抗原包被板，12 1х8 条。纯化的
人 NTx 抗原吸附到微孔条中（1 块）

浓缩抗体结合物，1 管。纯化的鼠抗
NTx 单克隆抗体，结合有辣根过氧化
物酶，ProClin
倍浓缩（0.4ml）

(0.05%)作为防腐剂，100

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CONJ DIL

WASHBUF 30X

CHROMOGEN

BUFFER

SOLN STOP

CAL xx nM

CONTROL xx

试剂贮存

试剂不用时必须放 2-8
将试剂暴露于 30 oC 以上或 2 oC 以下的环境中，稀释后的冲
洗液可以在室温存放一个月。

需要但未提供的材料

 能加样 25µl，100µl 和 200µl 体积的单挡或多挡加样器
 一次性加样头
 一次性塑料容器
 自动洗板机
 微量板光学读数仪，读数仪能在 450nm 波长和 630nm

参考波长下读数且能测定从 0 到 3.000 的光密度

 能计算四参数曲线的软件
 去离子水

尿液标本的收集和贮存
 收集晨尿标本或 24 小时尿标本，盛在带盖的密闭容器

中。

 尿标本中不要加防腐剂。
 带血标本或溶血标本可能对测定造成影响，应当弃去，

建议重新收集标本。

 标本冷冻（2-8

冰冻（≤20 oC）可长期保存。标本可经受 3 次冻融。

 监测治疗时，基准标本应该在治疗开始前收集，后续收

集的用于比较治疗效果的标本收集的时间应与基准标
本收集的时间一致。

注意事项

 仅供体外诊断用
 抗原包被的 96 孔板、标准品和尿液质控品中含有从人

尿液和/或骨组织中提呈的抗原，应当按潜在感染品作适

抗体结合物稀释液，1 瓶。是用于稀释
浓缩抗体结合物的缓冲液，ProClin

(0.05%)作为防腐剂
30 倍浓缩冲洗液，1 瓶。离子清洁液。

(125 ml)

显色剂，1 管。溶于二甲基亚砜的四甲
基联苯胺，100 倍浓缩。（0.9 ml）

基质缓冲液，1 瓶，过氧化氢缓冲液。
（30 ml）

终止液。1 瓶，1N 硫酸。（25 ml）。注：
有些成份中含有牛血清或牛血清白蛋
白。

分析用标准品：1，30，100，300，1000，
3000 nM BCE，各 1 管。纯化的 NTx
抗原溶于缓冲液中，ProClin (0.05%)
作为防腐剂。（各 0.4 ml）

尿液质控品 I、II。各 1 管，是含已知
NTx 浓度的人的尿液，ProClin (0.05%)
作为防腐剂。（各 0.4 ml）

o

C 保存，用前平衡至室温，不要

o

C）可保存 72 小时，室温保存 24 小时，

当处理。

 终止液含有 1N 硫酸，不要测到皮肤和眼睛中。一旦被

测，立即用水冲洗 15 分钟，测入眼睛时要立即就医。

 显色剂中含有四甲基联苯胺（TMB）和二甲基亚砜

（DMSO）。二甲基亚砜易被皮肤吸收，吸入、接触皮
肤或吞咽都会造成伤害，一旦暴露，应立即用流水冲洗
暴露部位 15 分钟，如果测入眼中，立即去看医生。

 尿液标本中可能含有传染原，应作正确外理，用 0.5%

o

的次氯酸钠溶液(家用漂白粉 1:10 稀释)或121
毒 1 小时，除污效果最佳。不要高压含有次氯酸钠的溶
液，也不要将次氯酸钠和酸混合。

 决不要用嘴吸试剂或临床标本。
 处理标本和试剂时要穿防护衣，戴防护手套，用完后彻

底洗手。

 不要使用过期试剂。
 不要将不同批号的试剂混合使用。
 微孔条必须干燥保存，未使用的板条应当用盛有干燥剂

的密封袋重新密封保存。

 微孔不可重复使用，用后正确处理。
 测定程序要在符合温育要求的可控实验环境中进行，测

试中要避开极端的环境条件。

测定程序

准备步骤：

1. 测定前至少将标本和试剂在室温（18~28℃）平衡 1 小时。

2. 准备工作强度冲洗液。将 30X 浓缩冲洗液用去离子水以

3. 做一显示标准品、质控品和尿标本位置的板图。建议标

1 2 3

A

B

C

D

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F

G

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4. 在一个干净一次性使用塑料容器中，用抗体结合物稀释

为了便于加温，将试剂从试剂盒中取出，冰冻状态的尿
标本，可用水浴或温育箱 37℃解冻，然后带至室温。显
色剂中含有二甲基亚砜，在冰冻状态是固体，在室温是
液体。

1:30 稀释（1 份 30X 浓缩洗涤液＋29 份去离子水）。至
少混匀 5 分钟，稀释后的冲洗液在室温可稳定 1 个月。

准品、质控品和尿标本都做双份，下面是测试 4 份标本
的示例：

1 nM 标准品 1000 nM 标准品 1号标本

1 nM 标准品 1000 nM 标准品 1号标本
30 nM 标准品 3000 nM标准品 2号标本
30 nM 标准品 3000 nM标准品 2号标本

100 nM 标准品 质控品 I 3 号标本
100 nM 标准品 质控品 I 3 号标本

300nM 标准品 质控品 II 4 号标本
300nM 标准品 质控品 II 4 号标本

液将浓缩抗体结合物以 1:101 的比例稀释。参照；每条
抗原包被的微孔条，需用 2ml 抗体结合物稀释液稀释

20µl 浓缩抗体结合物，轻轻旋转混匀，不要形成涡流，

C 高压消

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也不要使用磁搅拌棒，以免形成泡沫。工作强度结合物
液 1 小时内使用，容器不可重复使用。

5. 测定前轻轻混匀标准品、质控品和尿液标本，不要形成
泡沫。云雾状或混浊标本放置 5-10 分钟再吸样，含颗粒
尿标本用前可离心。

6. 从密封锡箔中取出需要数量的微孔条，剩余部分放回密
封袋，沿拉链密封，干燥剂要保留。

标本和抗体的温育：

测定一旦开始，请不要间断。

7. 根据步骤 3 中板的布局，各加 25µl 的标准品、质控品、
尿液标本于相应的微量板孔中。加样器要经过校准，每
次加样后都要换用一个新吸头。

8. 用多挡加样器向每个加样孔中加入 200µl 工作强度结合
物液，盖密封条，在平面上将板轻轻混匀 5-10 秒钟。

9. 在室温（18~28

10. 在温育的最后 10 分钟准备显色剂/基质缓冲液。用基质

缓冲液将显色剂以 1:101 的比例稀释。参照：每条抗原
包被条需要用 2ml 基质缓冲液稀释 20µl 显色剂。将基质
缓冲液加到一个一次性塑料容器中，将显色剂充分混匀
后加入到基质缓冲液中，轻转混匀，不要巨烈摇动或使
用磁搅拌棒。配制的显色剂/基质缓冲液要在 30 分钟内
使用。混匀后溶液应当是无色的，兰色表明试剂被污染，
应当弃去。配制显色剂/基质缓冲液的容器不可再用。

11. 温育结束，小心揭去密封条，在自动洗板机上用工作强
度冲洗液洗孔 5 次，每个冲洗循环每孔最少用 350µl 冲
洗液。冲洗过程中每孔中应注满工作强度冲洗液。冲洗
完毕，抓住板的四周中部,倒转,在吸水纸上拍干。立即
按下所述加入显色剂/基质缓冲液。

显色和测量：

12. 用一多挡加样器向每孔中加入200µl 步骤10 中准备的显
色剂/基质缓冲液，盖一新封条。

13. 在室温温育 15±1 分钟，结合有辣根过氧化物酶标记抗
体的孔中会有兰色出现。

14. 温育结束，小心揭去封条。用一多挡加样器按加显色剂
/基质缓冲液同样的顺序向每孔中加入 100µl 终止液，兰
色孔中颜色将变为黄色。

15. 在平面上将板轻轻旋转混匀 5-10 秒钟，将板在室温放置
5 分钟后测吸光度值。

16. 加终止液后 30 分钟内，用微量读数仪读取标准品、质
控品和尿液标本的吸光度（波长 450nm,参考波长
630nm）。读数仪的最大光度读数应当≥3.000。

结果分析
1． 用四参数对数曲线固定方程作出标准曲线测定质控品

和尿液标本的浓度值（nM BCE）。

o

C）温育 90±5 分钟。

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例如：

2． 结果在满足下列条件的情况下是有效的：

 1nMBCE 标准品的吸光度均值必须≥1.500
 标准曲线的范围(1 nM BCE 标准品和 40 nM BCE 标准

品的吸光度差异)必须≥1.300

3． 推荐的双份测定尿标本浓度值的变异系数(%CV)是≤

20%，变异系数>20%的样本应当重测。
4． 测定低限是 20 nM BCE（不包括肌酐调整值）。
5． 超过 3000nMBCE 的尿标本可以用 200-500 nM BCE 范

围的尿标本 1:5 稀释后重测。当用尿液做稀释液时，稀

释液的nM BCE 值也在同一板块中以同样的方式测定出

来。稀释因子和背景（稀释液的 nMBCE）也要合并计

算。

例如：用 Osteomark 值是 300nMBCE 的尿液做稀释液，
以 1:5 的比例稀释 4000nMBCE 的标本，测得值为 1040 nM

BCE

1040 nM BCE-(0.8×300 nM BCE)= 800 nM BCE

800nMBCE×5(稀释因子)= 4000 nM BCE

注：1:5 稀释表示 80%（0.8）是稀释液，20%是标本。
6． 尿标本的报告浓度值为 nMBCE/mM 肌酐，如下例所示：

测定值 = 360nMBCE

尿肌酐值 = 60mg/dl 肌酐÷11.3* = 5.3mM 肌酐

300nMBCE÷5.3mM 肌酐 = 68nMBCE/mM 肌酐

*注：将毫克每升转化为毫麾尔每升的转化因子。
7． 制造商已经建立了尿液质控范围，建议每个试验室确立

自已的质控范围。

局限性

虽然 Osteomark 被用作骨吸收的标记物，但尚未用于预
测骨质疏松症的形成和未来发生骨折的风险，也未用于诊断
原发性甲状旁腺机能亢进、甲状腺机能亢进。当用 Osteomark
监测治疗效果时，可能会受到影响骨吸收的其他临床条件的
影响，例如：骨转移，然而 Osteomark 提供了一种检测骨吸
收水平的方法。由于报告结果不包含时间因素，单一的
Osteomark 值不能提供骨吸收率。Osteomark 结果应当结合临
床和其他诊断结果综合分析。

干扰物质

对尿液中各种可能对 Osteomark 测定造成干扰的成份和
微生物进行了评估。已检测微生物，如：大肠埃希菌（ATCC

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25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、白色假丝酵母菌
（ATCC 14053）都对测定无干扰，人白蛋白、胆红素、糖和
维生素 C 对测定也无干扰。血尿标本和溶血标本可能对测定
造成干扰，应当弃去，重留。

预期值

为了确立停经前妇女（年龄 25~49 岁，平均年龄 36 岁）
和男子（年龄 31~87 岁，平均年龄为 56 岁）的参考范围进行
了一项多重交叉研究。

表 1：男子和停经前妇女 Osteomark 值预期范围

均值* 标准差 范围(均值±SD)*
妇女
男子

停经前妇女的预期值范围经对数转换后变为

14-74nMBCE/mM 肌酐，经对数转换后的男性参考范围为
13-78nMBCE/mM 肌酐。
从对健康绝经后妇女（n=276，268）和 30 岁以上的男人（n=36，
35）的前瞻性研究中确立了短期和长期变异。连续收集 3-4

天尿标本测定短期变异，连续收集 2-3 个月尿标本测定长期
变异。短期变异：妇女是 15%，男子是 18%。长期变异：妇
女是 18%，男子是 19%。

操作特性
重复性和精密度
批内测定变异
10 次而评估的。结果如下：

批间测定变异是由一个操作者对3 份尿标本重复测定20 次而
进行评估的。结果如下：

总测定精密度是通过30 天中在3 家临床实验室测定尿液质控
品 I 和尿液质控品 II 进行评价的。尿液质控品 I 的均值为 439

nMBCE，变异系数为 10%，尿液质控品 II 的均值是 1537
nMBCE，变异系数为 7%。

抗原回收

35 15 5 - 65 258

33 15 3 - 63 206

*以 nMBCE/mM 肌酐表示

是由 4 个操作者分别对 8 份尿液标本重复测定

标本 均值（nMBCE） 变异系数(%)

A 26 19

B 111 8

C 172 8

D 417 5

E 694 5

F 1113 5

G 1768 6

H 2640 5

标本 均值（nMBCE） 变异系数(%)

A 79 5

B 412 3

C 1167 4

N

抗原回收是通过向 3 份已知 NTx 浓度的尿标本中加入已
知量的 NTx 来评价的。回收表示测得值占理论值（尿液基准
值加新加入的抗原(NTx)值）的百分比。结果表明抗原回收率
是 105%。

稀释线性

稀释线性是通过对 4 份高 nMBCE 的尿液标本用
200-500nMBCE 的尿液标本做系列稀释来评价的。结果显示
相关系数 r=0.999 或 r=1.000。

临床研究
Osteomark 在绝经后妇女中的应用

为了测定 Osteomark 测定在监测激素替代疗法（HRT）
对骨吸收的影响方面的能力，以及预测对 HRT 的反应，对绝
经早期妇女进行了一项试验。结果支持对绝经早期妇女用
Osteomark 监测激素抗吸收治疗，以及预测骨密度（BMD）
对 HRT 的反应性改变，这种改变可以用双能量 X 线吸收仪测
定。因此，象测量骨密度一样，可以确定谁将从这种治疗中
获得最大益处，以及谁有骨量降低的风险。治疗组和对照组
的四项对比检查提供了 BMD 降低的风险信息（表 2）：在最
低 NTx 四分位限(≤38nMBCE/mM 肌酐)，HRT 组和对照组 1
年后骨质降低的可能性无显著性差别，高基准值
NTx(>67nMBCE/mM 肌酐)，在不用 HRT 治疗时，风险增长
了 17.3 倍。

表 2.比较钙组和 HRT 组 BMD 降低的相对风险

NTx*基准值(nMBCE/m 肌酐) 相对风险

18 - 38 1.4 0.8-2.5

38 - 51 2.5 1.0-6.1

51 - 67 3.8 1.6-9.1

67 - 188 17.3 2.5-118.5

*N=54，53，57，55

Osteomark 在诊断为骨质疏松病人中的应用

进行了一项研究来确立一种新药氨基双磷酸
（alendronate）在治疗骨质疏松症方面的安全性和功效。下列
资料支持 Osteomark 用于监测因患骨质疏松症而抗吸收治疗
(alendrote 10mg)的妇女的骨吸收水平。

 治疗三个月后，80%（71/89）的受试者 Osteomark 值≤

35 nMBCE/mM 肌酐，87%（76/87）的受试者有 40%以
上的降低。

 治疗一年后，90%（77/86）的受试者 Osteomark 值≤35

nMBCE/mM 肌酐，92%（77/84）的受试者有 40%以上
的降低。

 因此，患骨质疏松症抗吸收治疗后妇女的 Osteomark 值，

三个月后应当≤35 nMBCE/mM 肌酐，或有 40%以上的
降低。

Osteomark 在诊断为佩吉特骨病的病人中的应用

进行了一项研究来测定 Osteomark 监测佩吉特骨病病人
用双磷酸盐治疗后影响骨吸收的能力。以下资料支持

Osteomark 用于监测佩吉特骨病病人采用双磷酸盐治疗对骨

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