HopeYearr OSTEOMARK NTx Serum User Manual

OSTEOMARK® NTx Serum

试剂盒说明书

定量检测人血清中的 I 型胶原交联氨基末端肽(NTx)

NTx 是反应骨吸收情况的指标

适用范围

血清 NTx 水平有助于预测骨骼对抗吸收治疗的反应（骨
密度），以及监测抗吸收治疗开始后骨吸收的改变。血清 NTx
水平在用于抗吸收治疗前，先是被用于测定绝经后妇女用激
素抗吸收治疗和补钙治疗一年后骨密度降低的相关性。

Osteomark NTx Serum 的测量范围是 3.2~40.0nM 骨胶原
当量（BCE）。

摘要和试验解释

哺乳动物骨通过破骨细胞介导的骨吸收和随后成骨细胞
介导的骨形成的连续过程，而不断地重塑，这个过程对骨骼
的正常发育和维持是必不可少的，这个紧密给合过程的异常
往往导致骨量和形状的改变。对特异的骨降解产物的测量，
可以为研究骨代谢率提供分析数据。约 90%的骨组织基质是
І 型胶原，І 型胶原是一种分子 C 端和 N 端交联的螺旋蛋白，
这种蛋白组成了骨组织的基本结构和张力。

交联的 І 型胶原 N 端肽的发现为骨吸收提供了一种物异
的生化标记物，这种标记物可以用免疫测定法分析。NTx 分
子对骨的专一性基于其氨基酸顺序的独特性和交联 α
的定位作用。NTx 分子的产生是骨中破骨细胞介导的，作为
一种稳定的降解终产物可存在于血液和尿液中。

血清中 NTx 作为人类骨吸收的一种标志物，可用

Osteomark NTx Serum 定量测定。血清 NTx 水平的升高即表

1，2，3，4

明骨吸收水平的升高
高是与年龄有关骨损失的首要原因，低骨量常常导致骨质减
少，是骨质疏松症的主要原因
是老年女性发病率和死亡率升高的主要来源。

在美国的八个临床点对绝经后妇女进行了一次随机试
验，受试者随机接受激素替代疗法（HRT）加钙补充（500mg/
天），或仅进行钙补充
Osteomark NTx Serum 法测量。试验结果支持用 NTx 监测抗
吸收治疗的效果和测定不用激素治疗一年后骨密度降低的可
能性。

在一家地级专业医院对低骨量或诊断为骨质疏松症的绝
经后妇女进行了一项随机、双盲临床研究，受试者随机接受
安慰剂或 5~10mg alendronate sodium
清标本用 Osteomark NTx Serum 法测定，研究结果支持血清
中NTx 用于监测抗吸收治疗的效果和用血清NTx 值的早期改
变预测骨密度对治疗的反应。

。临床研究表明，骨吸收水平升

5，6

。据报道，骨质疏松性骨折

7

，研究期间收集的血清标本用

8

。研究期间收集的血

N 端肽

2

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测定原理

Osteomark NTx Serum 是一种竞争抑制酶联免疫吸附测

定（ELISA/EIA），用于测定人类血清中 NTx。

NTx 表位被吸附到 96 孔微量板中，将稀释后的标本加到
微量板孔中，继之加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体。
病人标本中的 NTx 与微量板中的 NTx 表位竞争抗体结合点，
经冲洗后，结合的标记抗体量可以通过显色的过氧化物基质
比色测定，吸光度可以用分光光度法测量，NTx 的浓度可以
通过标准校准曲线计算出来，测定值用 nmol 骨胶原当量/升
报告(nMBCE)。

试剂盒组成
所供材料足够 96 人份用

A

B

C

D

E

F

G

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0

5

10

20

40

I

II

试剂描述

说明书 1份
抗原包被的 96 孔板 12х8 孔条 1块
标本稀释液 40ml 瓶
浓缩抗体结合物 0.4 ml 管
抗体结合物稀释液 25 ml 瓶
显色剂 0.9 ml 瓶
缓冲液 30 ml 瓶
终止液 25 ml 瓶

30х 浓缩冲洗液 125 ml 瓶
0 nMBCE 标准品 20 ml 管
5 nMBCE 标准品 0.4 ml 管
10 nMBCE 标准品 0.4 ml 管
20 nMBCE 标准品 0.4 ml 管
40 nMBCE 标准品 0.4 ml 管

血清质控品 I 0.4 ml 管
血清质控品 II 0.4 ml 管
板封条 1包

PLATE

DILSPE

CONJ

CONJ DIL

CHROMOGEN

BUFFER

SOLN STOP

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96 孔抗原包被板。12 1х8 条，合成的
NTx 抗原吸附到微孔条中

标本稀释液。1 瓶，用于稀释标准品、
质控品、标本的缓冲液，ProClin
(0.05%)作为防腐剂。

浓缩抗体结合物。1 管，纯化的鼠抗 NTx
单抗，结合有辣根过氧化物酶，ProClin
(0.05%)作为防腐剂，浓缩 100 倍。

抗体结合物稀释液。1 瓶，用于稀释浓
缩抗体结合物的缓冲液，ProClin
(0.05%)作为防腐剂。

显色剂。1 管，溶于二甲基亚砜的四甲
基联苯胺，浓缩 100 倍。

缓冲基质液。1 瓶，过氧化氢缓冲液，
用于稀释显色剂。

终止液。1 瓶，1N 硫酸。

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WASHBUF 30X

CAL xx nM

CONTROL XX

试剂贮存

试剂不用时必须放 2-8
将试剂暴露于 25 oC 以上的环境中，稀释后的冲洗液可以在室
温存放一个月。

需要但未提供的材料

 精密的单挡或多挡加样器
 加样头（测定过程中，每次加入不同样品或试剂时都必

须更换新吸头）

 准备稀释用的微管或类似容器
 准备工作结合物和显色剂用的一次性塑料容器
 试剂储存器
 自动洗板机
 带有 450nm 和 630nm 滤光片的微量读数仪
 能用 4 参数对数曲线固定方程计算结果的软件
 去离子水

标本收集和贮存

通过标准静脉穿刺收集的人类血清可用于 Osteomark
NTx Serum 测定，目前，血浆标本尚不能使用。要让血液充
分凝固，及时分离血清，对用分离管收集的血清要除去凝胶
颗粒。血清标本冷冻状态下（2~8
状态（≤20 oC）可长期贮存。标本可冻融 3 次。

为了监测治疗效果，应该在治疗开始前或治疗当日收集
基准标本，后续收集的用于比较治疗效果的标本收集的时间
应与基准标本收集的时间一致。

注意事项

 仅供体外诊断用
 尤其在监测治疗效果时，不可将 Osteomark NTx Serum

值和 Osteomark NTx Urine 值交替使用。

 标准品和质控品中含有从人骨组织或血清中提呈的抗

原，应当按潜在感染品作适当处理。

 显色剂中含有四甲基联苯胺（TMB）和二甲基亚砜

（DMSO）。二甲基亚砜易被皮肤吸收，一旦接触皮肤，
应立即用水冲洗 15 分钟，如果测入眼中，立即去看医
生。TMB 疑有致癌作用。

 血清样品可能含有传染因子，应作正确外理，用 0.5%

的次氯酸钠溶液(家用漂白粉 1:10 稀释)或 121
毒 1 小时，除污效果最佳。不要高压含有次氯酸钠的溶
液，也不要将次氯酸钠和酸混合。

30X 冲洗液。1 瓶，离子清洁液。

标准品：0，5，10，20，40nMBCE。各

1 管，溶于稳定的蛋白稀释液的纯化的
NTx 抗原，ProClin (0.05%)作为防腐剂。

血清质控品 I、II。各 1 管，是已知 NTx
浓度的人类血清，ProClin (0.05%)作为
防腐剂。

o

C 保存，用前平衡至室温，不要

o

C）可贮存 24 小时，冰冻

o

C 高压消

 决不要用口吸试剂和样品
 终止液含有 1N 硫酸，不要测到皮肤和眼睛中。一旦被

测，立即用水冲洗 15 分钟，测入眼睛时要立即就医。

 不要使用过期试剂。
 不要将不同批号的试剂混合使用。
 微孔条必须干燥保存，不要将干燥剂从锡箔中丢弃，未

使用的板条应当用盛有干燥剂的密封袋重新密封保存。

 微孔不可重复使用，用后正确处理。
 测定程序要在符合温育要求的可控实验环境中进行，测

试中要避开极端的环境条件。

检测步骤

准备步骤：

1. 将标本和试剂平衡至室温（20-25oC）。将试剂充分混匀,

2. 准备工作强度冲洗液。将 30X 浓缩冲洗液用去离子水以

3. 规化板结构，创立一个板图。建议每份标准品和质控品

4 . 准备工作强度结合物液。在一个干燥洁净的一次性容器

5. 彻底混匀标准品、质控品和标本。

6. 在微量管或类似容器中，用标本稀释液将标准品、质控

7. 从密封锡箔中取出需要数量的微孔条，剩余部分放回密

标本和抗体的温育：

避免泡沫形成。

1:30 稀释（1 份 30X 浓缩洗涤液＋29 份去离子水，例如
用 870ml 去离子水稀释 30ml 浓缩冲洗液）。至少混匀 5
分钟，稀释后的冲洗液在室温可稳定 1 个月。

都做双份，下面是 8 个标本的示例：

1 2 3

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B

C

D

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F

G

H

中，用抗体结合物稀释液将浓缩抗体结合物以 1:10 比例
稀释，轻轻旋转混匀，不要形成涡流，也不要使用磁搅
拌棒，以免形成泡沫。容器不可重复使用，按下面图表
所示准备试剂

品、标本以 1:5 稀释（1 份样品+4 份标本稀释液），每个
样品至少需要稀释200µl（例如 50µl 样品+200µl 稀释液），
将稀释样品充分混匀，避免泡沫形成。

封袋，沿拉链密封，干燥剂不要丢掉。

0 标准品 40 标准品 3号标本
0 标准品 40 标准品 4号标本
5 标准品 质控品 I 5 号标本

5 标准品 质控品 I 6 号标本
10 标准品 质控品 II 7 号标本
10 标准品 质控品 II 8 号标本
20 标准品 1号标本 9号标本
20 标准品 2号标本 10 号标本

总条数 浓缩结合物(µl) 结合物稀释液(µl)

3 - 4 40 4

5 - 8 80 8

9 - 12 120 12

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8. 根据板的布局，各加 100µl 稀释后的标准品、质控品、标
本于相应的微量板孔中。建议标准品和质控品都要做双
份，加样器要经过校准，每次加样后都要换用一个新吸
头。加样完毕，立即转入步骤 9。

9. 向每个加样孔中加入 100µl 工作强度结合物液，盖密封
条，在平面上将板轻轻混匀 15-20 秒钟。

o

10. 在室温（20-25

11. 在温育的最后 5 分钟准备显色剂和缓冲基质液。在一个

一次性使用干净容器中用缓冲基质液将显色剂以 1:101
的比例稀释，颠倒混匀，不要形成涡流、巨烈摇动或使
用磁搅拌棒（混匀后溶液应当是无色的，兰色表明试剂
被污染，应当弃去），每条测定通常要准备2ml 溶液(20µl
显色剂＋2ml 缓冲基质液)。

12. 温育结束，小心揭去密封条，在自动洗板机上用工作强
度冲洗液洗孔 5 次，每个冲洗循环每孔最少用 350µl 冲洗
液。最后一遍冲洗后在吸水纸上拍干（过少或过多的冲
洗都会造成结果的不准确）。在测定条风干前迅速进入步
骤 13。

显色和测量：

13. 每孔中加 200µl 稀释后的显色剂/缓冲基质液，盖一新封
条。

14. 室温（20-25 oC）温育 30±2 分钟，结合有抗体辣根过氧
化物酶结合物的孔中会有兰色出现。

15. 温育结束，小心揭去封条。

16. 每孔加 100µl 终止液，兰色孔中颜色将变为黄色，在平面

上将板轻轻旋转 15-20 秒钟，将板在室温（20-25
置 5 分钟后测吸光度值。

17. 加终止液后 30 分钟内用微量读数仪读取标准品、质控品
和标本的吸光度（波长 450nm,参考波长 630nm）。

结果分析

1. Osteomark NTx Serum 值用 nmolBCE/L 表示(nM BCE)。

2. 从标准曲线上取得质控品和样本的浓度值(nM BCE)，最

精确的结果可以用四参数对数曲线固定方程式求得（注：
某些四参数对数曲线固定方程软件包不接受 0 值标准
品，要求输入一个极小的浓度（例如 0.001）代替 0 nM

BCE 标准品）。

3. 结果在满足下列条件的情况下是有效的：

 0 nM BCE 标准品的吸光度均值≥1.300
 标准曲线的范围(0 nM BCE 标准品和 40 nM BCE

标准品的吸光度差距)≥0.900

4. 如果样品作了双份测定，双份测定浓度值的变异系数
(%CV)≤20%是可接受的，变异系数>20%的样本应当重
测。

5. 病人样本吸光度值<40nMBCE 标准品吸光度值的，应当

用 0nMBCE 标准品以 1:2 稀释后重测，如若结果仍低，
改用样品稀释液以 1:5 的比例稀释后重测，稀释后样品测
定出的浓度值乘以稀释倍数即得原始结果。

C）温育 90±5 分钟。

o

C）放

6. 制造商已经建立了血清质控范围，建议每个试验室确立

自已的质控范围。

局限性

虽然 Osteomark NTx Serum 被用作骨吸收的标记物，但
尚未用于预测骨质疏松症的形成和未来发生骨折的风险，也
未用于诊断原发性甲状旁腺机能亢进、甲状腺机能亢进和佩
吉特骨病。用 Osteomark NTx Serum 监测治疗效果时，可能
会受到影响骨吸收的其他临床条件的影响，例如：骨转移。
虽然 Osteomark NTx Serum 提供了一种检测骨吸收水平的方
法，由于报告结果不包含时间因素，单一的 Osteomark NTx
Serum 值不能提供骨吸收率。Osteomark NTx Serum 结果应当
结合临床和其他诊断结果综合分析。

干扰物质

对总胆红素、直接胆红素、糖、胆固醇、甘油三脂、总
蛋白、白蛋白、血红蛋白等可能干扰 Osteomark NTx Serum
测定的血清成份进行了评估，结果发现，在高于生理水平的
情况下均未对测定造成干扰。

预期值

在 5 个地点对停经前健康女性（年龄 25~49 岁，平均年
龄 36 岁）的参考范围进行了多重交叉研究，对男性（年龄
31~80 岁，平均年龄为 51 岁）的参考范围在 3 个地点进行了
多重交叉研究。

女性
男性

停经前女性的预期值范围经对数转换后变为 7.7-19.3nM
BCE，经对数转换后的男性参考范围为 8.1-24.8nM BCE，此
参考范围仅供参考，每个试验室应建立自已的参考范围。为
了测定停经后妇女血清中 NTx 的批内变异情况，特地进行了
一项研究。受试者连续提供 3 天的血标本用于评估短期变异，
连续提供 2 个月的标本用于评估长期变异。短期变异系数均
值为 7.3%(n=271)，长期变异系数是 8.7%(n=261)。在对上述
男性批内变异的评估中，短期(14 天)批内变异(n=32)是 9.1%，
长期(3 月)批内变异(n=27)是 9.5%。

操作特性
测定重复性和精密度

批内变异 是依照 NCCLS 精密度操作规程 EP5-T2，用 4
份BCE 值遍布标准测量范围的人血清测得的，Osteomark NTx
Serum 的批内变异值是 4.6%。

批间变异
标本测得的，批间变异值是 6.9%。

精密度
BCE）和血清质控品 II (30.0 nM BCE)进行评价。

血清质控品 I 的精密度是 13.99%，血清质控品 II 的精密

均值 标准差 范围(均值±2SD)

12.6 3.2 6.2 - 19.0 257

14.8 4.7 5.4 - 24.2 176

是用 BCE 值遍布标准测量范围的 8 份人血清

通过在 4 家实验室测定血清质控品 I （9.4 nM

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度是 11.92%。

抗原回收 是通过向 9 个已知 NTx 浓度的血清样品中加
入已知量的 NTx 来评价的。回收表示测得值占理论值的百分
比，结果表明抗原回收率是 94-105%。

稀释线性
nMBCE 值的血清样品做系列稀释来评价的。线性百分数为测
得值除以预期值×100，结果表明线性稀释样品的平均回收率
是 98%。

临床研究
Osteomark NTx Serum 在用 HRT 治疗的绝经后妇女中的应
用

为了检测 Osteomark NTx Serum 对监测 HRT 影响骨吸收
的能力，以及补钙治疗与补钙加 HRT 治疗一年后骨密度降底
的可能性，进行了一次临床试验，研究结果支持这些论断。
图 1a 和图 1b 提供了整个研究过程中， 每个治疗组的

Osteomark NTx Serum 值。HRT 开始前，该组 Osteomark NTx
Serum 的平均基准值是 15.9nMBCE，显著高于绝经后均值

12.6nMBCE。在 HRT 组，NTx 值在治疗 6 个月后显著降低至

于 11.9 nMBCE，平均下降 24.4%（图 2）。钙治疗组，12 个
月的研究中均值保持稳定，基准值为 15.4 nMBCE ，12 个月
后为 15.8 nMBCE。对 HRT 和补钙组骨损失的风险从 NTx 的
基准值进行了比较，在 NTx 基线四分位线的最低值
（<12.5NMBCE＝，HTR 组和钙组一年后在骨损失的可能性
方面无统计学显著差异。如果没用 HRT 治疗，高基准 NTx
（>18.1 nMBCE）显示骨密度损失的风险增长了 6 倍。

图 1a. 钙组---整个研究期间 Osteomark NTx Serum 值（图略，
请参见原文说明书）
图 1b. HRT 组---整个研究期间 Osteomark NTx Serum 值（图
略，请参见原文说明书）
图 2. Osteomark NTx Serum 骨质变化率和变化百分率（图略，
请参见原文说明书）

Osteomark NTx Serum在用双磷酸盐治疗的绝经后妇女中的
应用

在美国东北部的一家区级专科医院进行了一项研究，目
的是为了检测用双磷酸盐治疗后的 Osteomark NTx Serum 的
早期改变是否意味着骨密度的升高

是通过将 5 个高nMBCE 的血清样品用已知低

8

。在这项双盲临床研究

重要提示：

中，妇女被随机分组，接受安慰剂或 5~10mg 双磷酸盐。在
双磷酸盐治疗组，6 个月后 Osteomark NTx Serum 均值是 11. 0
nMBCE，显著低于 16.1 nMBCE 的基准线（图 3a 和 3b）。
图 3a. 安慰剂组---整个研究期间 Osteomark NTx Serum 值（图
略，请参见原文说明书）
图 3b. 双磷酸盐组---整个研究期间 Osteomark NTx Serum 值
（图略，请参见原文说明书）
图 4，Osteomark NTx Serum 骨密度变化率和变化百分率（图
略，请参见原文说明书）

参考文献
略，请参见原文说明书

Osteomark NTx Serum 快速参考指南

1． 先将测定程序通读。
2． 把所有血清标本和试剂放至室温，将试剂彻底混匀。
3． 准备工作强度冲冼液，用去离子水将 30×浓缩洗涤液

1:30 稀释。
4． 安排板结构，给出一个板图。
5． 准备1:101 稀释的工作强度抗体结合物液，每条约需要

1ml。
6． 在微量管或类似容器中准备1:5 稀释的标准品、质控品

和标本。
7． 根据板图各加 100µl 的标准品、质控品和标本于相应

的板孔中。
8． 向各孔中各加入100µl 工作强度抗体结合物液，盖板，

轻轻旋转混匀，在室温温育 90±5 分钟。
9． 在温育的最后 5 分钟，准备 1:101 倍稀释的显色剂/缓

冲基质液，每条约需 2ml。
10． 用工作强度冲洗液洗板 5 次，最后 1 次后在吸水纸上

拍干。
11． 每孔中加入 200µl 稀释过的显色剂/缓冲基质液，盖板，

室温温育 30±2 分钟。
12． 每也中加入 100µl 终止液，轻轻转动混匀。
13． 室温温育5 分钟，在450nm-630nm 读取每孔吸光度值，

用四参数对数曲线固定方程计算结果。

本中文译稿仅供参考。

开始试验前务必详细阅读试剂盒所附英文说明书，

并严格按照英文说明书进行操作。谨防有误。

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