GeneCopoeia First Strand cDNA Synthesis User Guide

使用说明书

First Strand cDNA Synthesis Kit

产品套装编号：C0210A

GeneCopoeia

Expressway to Discovery

GeneCopoeia Inc.
19520 Amaranth Drive
Germantown, Maryland 20874
USA
Tel: [phone]
Fax: [phone]
Web: www.genecopoeia.com

TM

产品内容

M-MLV Reverse Transcriptase (RNase H-)
5×RT Reaction Buffer
RNase Inhibitor
25mM dNTP
60 µM Oligo(dT)
250 µM Random Primer
ddH

O (DNase/RNase Free)

2

18

产品编号

C02010A
C02011A
C10200A
C10011A
C10210A
C10220A
C10230A

包装规格

50 μl (200 U/μl)
250 μl
50 μl (2
50 μl
50 μl
50 μl
1 ml

5 U/μl)

储存条件：-20℃保存

产品概述

■

：

RNA逆转录成的单链cDNA是基因克隆和RNA研究的主要材料。本产品是采用莫洛尼鼠白血病病毒

(Moloney Murine Leukemia Virus) 逆转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase)来合成单链cDNA

的专用试剂盒。由于阻碍cDNA长链合成的RNase H 活性的缺失，使得M-MLV具有比野生型更强的依
赖RNA的DNA聚合酶延伸能力。

本产品中已包含有反应所需的所有试剂，用户只需提供RNA样品就可以进行逆转录实验。

注意事项

■

：

1．本试剂盒应在-20℃储存。
2．用前应缓慢颠倒混匀试剂，避免起泡，并经轻微离心后再使用。
3．为避免RNase污染，提高逆转录效率，请按照使用说明书来进行逆转录实验。

操作流程

■

：

st Strand cDNA合成前准备

1．Fir

为避免RNase对RNA的降解，提高逆转录效率，在实验前需准备高温高压灭菌的微量离心管和

移液枪头。实验操作时，需戴口罩和一次性橡胶手套。所有反应液的配制等操作都需在冰上进行。

2．First Strand cDNA合成流程（例）

1) 融解反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。

2) RNA-Primer Mix的配制
在放置于冰上的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μl

试剂组分

total RNA 或
Poly(A) mRNA
60 µM Oligo(dT)
250 µM Random Primer 或
10 µM Sequence-Specific Primer

ddH2O (DNase/RNase Free)

※

在一个反应中模板的使用量可以适当调整：total RNA可调整在10 ng到5 μg之间，mRNA可

或

18

体积

1 µl
1 µl
1 µl

终浓度

1 µg

10 ng

2.4 µM
10 µM

0.4 µM

至总体积13 µl

调整在1 ng到100 ng之间。

※

引物 选 择 请 按 照实 验设 计要 求， 一 般只 需要 选择 Ol ig o( d T)18、Rando m P ri me r和

Sequence-Specific Primer三种中的一种即可。

3) RNA预变性
混匀RNA-Primer Mix，短暂离心，于70℃保温5分钟后立即放置冰上，有助于减弱RNA

二级结构对逆转录的影响，从而提高逆转录效率。

4) 配置逆转录反应液
在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25 μl。

试剂组分

RNA-Primer Mix
5×RT Reaction Buffer
25 mM dNTP
25 U/μl RNase Inhibitor
M-MLV RTase (RNase H
ddH2O (DNase/RNase Free)

总体积

-

)

体积

13 µl

5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
4 µl

25 µl

终浓度

1×

1 mM

25 U

200 U

5) 逆转录反应
混匀反应Mix，短暂离心后按要求进行反应：如反应液中添加的为Random Primer，

反应条件设置为37℃反应1小时；如反应液中添加的为Oligo(dT)

或Sequence-Specific

18

Primer，反应条件设置为42℃反应1小时。

6) 灭活并保存逆转录产物
反应结束后，85℃灭活处理5分钟，最后-20℃保存逆转录产物。

7) PCR 反应

First Strand cDNA 不需要纯化即可 进行下游PCR反应。一般取0.5到2 μl First
Strand cDNA作为模板添加到25 μl 常规PCR反应体系中；如果是Real-Time PCR，建
议添加稀释一定倍数的First Strand cDNA，一般取5 μl稀释了10～20倍的First Strand
cDNA作为模板添加到20 μl Real-Time PCR 反应体系中。

实验示例

■

：

1. 实验目的 ：通过常规PCR的方法来检测梯度稀释人源肝组织total RNA的逆转录产物中GAPDH
的含量，来验证逆转录的效率，GAPDH扩增片段长度为550 bp。

2. 操作流程：

1) 参考用First Strand cDNA Synthesis Kit的操作流程，用Oligo(dT)

逆转录1 μg human

18

liver total RNA。

2) 得到的First Strand cDNA 按照5的倍数稀释5倍、25倍、125倍、625倍、3125倍及不稀

释cDNA 共六个梯度，每个取1 μl进行PCR。

Taq

3) 利用常规PCR（采用Super

DNA Polymerase）扩增30 cycles得到550 bp左右的

GAPDH来验证逆转录效率。

结果如下：

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 12

M：DNA ladder
1-2：无稀释cDNA
3-4：5倍稀释cDNA
5-6：25倍稀释cDNA
7-8：125倍稀释cDNA
9-10：625倍稀释cDNA
11-12：3125倍稀释cDNA
取5 ul电泳，1.5% agarose gel

3 实验结论

从常规PCR的结果发现：逆转录产物稀释3125倍后还能扩增出较明显的PCR条带，说明

其具有良好的逆转录效率。

授权生产厂商:

广州复能基因有限公司

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