GeneCopoeia C0201A User Guide

使用说明书

M-MLV Reverse Transcriptase (RNase H-)

产品套装编号：C0201A

GeneCopoeia

Expressway to Discovery

GeneCopoeia Inc.
19520 Amaranth Drive
Germantown, Maryland 20874
USA
Tel: [phone]
Fax: [phone]
Web: www.genecopoeia.com

TM

产品内容

M-MLV Reverse Transcriptase (RNase H-)
5×RT Reaction Buffer

O (DNase/RNase Free)

ddH

2

产品编号

C02010A
C02011A
C10230A

包装规格

50 μl（200 U/μl）
250 μl
1 ml

储存条件：-20℃保存

产品概述

■

Leukemia Virus)逆转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase)，在适当的引物存在条件下能以单链
RNA或DNA为模板合成其互补DNA链。

M-MLV逆转录酶中RNase H活性的缺失，能增强其合成长链cDNA的能力。

来源

■

活性单位

■

量定义为1个活性单位(U)。

■ 纯度（

■

应用：

：

本产品为基因重组技术克隆表达的RNase H活性缺失型的莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine

野生型M-MLV逆转录酶含RNase H活性，可能降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。该突变型

：

大肠杆菌重组表达纯化。

：

以Poly (rA)为模板，Oligo (dT)为引物，在37℃条件下，10分钟内催化1 nmol dTTP掺入所需酶

品质检测

以考马斯蓝染色SDS-PAGE检测纯度大于90%，本品无核酸内切酶、外切酶及RNase污染。

1. cDNA文库构建。

2. RT-PCR反应及Real Time RT-PCR反应。

3. 引物延伸。

4. RNA测序。

）：

实验流程（First Strand cDNA合成

■

1. 在无RNase的已灭菌微型离心管中加入1 μl引物和1 μg Total RNA或10 ng mRNA，并加
O至13 μl。

ddH

2

2. 在70℃加热5分钟以破坏RNA二级结构。

3. 迅速置于冰上以阻止二级结构重新形成，然后短暂离心至管底。

4. 按下列顺序加入以下试剂至上述引物和模板的混合样品中：

）

：

5×RT Reaction Buffer
dNTP混合物(各25 mM)
M-MLV Reverse Transcriptase（200 U/µl）
RNase Inhibitor（25 U/µl）

加入ddH

O (DNase/RNase Free) 至总体积

2

5 µl
1 µl
1 µl
1 µl

25 µl

5. 轻柔混匀，用随机引物作为引物时37℃保温60分钟，其他引物42℃保温60分钟。

6. 85℃加热5分钟后冰上冷却。所得的cDNA可直接用于2nd-Strand cDNA合成或者PCR扩增。

储存条件

■

：

150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH7.6), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% NP-40和50%

甘油，-20℃储存。

使用注意事项（反应优化指南

■

1. Total RNA使用量一般为10 ng~5 μg，mRNA使用量一般为1 ng~100

）：

n

g。

2. 引物配制浓度可参考：Oligo (dT) 引物60 μM，随机引物250 μM，特异引物10 μM。

FAQ

■

：

1. 缺失RNase H的M-MLV逆转录酶与其他逆转录酶相比有什么优点？

答：从鸟类成髓细胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus)中纯化的AMV 逆转录酶和从

E.coli

重组表达的莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)中纯化的M-MLV逆转录酶是两
种最为常用的逆转录酶。AMV和M-MLV逆转录酶都有两种主要的活性：RNA依赖的DNA合成酶活性和

RNase H活性，其中RNase H是合成全长cDNA所不希望具有的。
一方面，RNase H会降解逆转录过程中形成的DNA/RNA杂交双链，从而降低cDNA合成的产量，

增加RNA模板的最小用量。另一方面，延伸过程中的RNA模板的降解也会导致cDNA合成的终止，从而
影响cDNA合

成的长度。通常情况在RNase H活性存在的条件下，合成大于5kb的全长cDNA是不合适
的。而缺失RNase H的M-MLV逆转录酶是通过基因重组技术形成的突变体，去除了RNase H活性的同
时不影响RNA依赖的DNA合成酶活性。因此，推荐在合成cDNA文库和全长cDNA时用去除RNase H
活性的逆转录酶。

中

2. RT反应需要用mRNA吗，是否可以用总RNA？

答：RT反应的RNA模板可以用总RNA或者mRNA。RT反应的成败主要取决于RNA的纯度，与RNA类
型无关。RNA整个提取过程中均需在无RNase的状态下进行。

该产品仅限于实验科学研究用，若有任何单位或个人将该产品用于临床诊断、治疗等其他国家专门规定的特殊用途，本公司概不承
担任何责任。

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