GeneCopoeia All-in-One User Guide

使用说明书

GeneCopoeia Inc.
19520 Amaranth Drive
Germantown, Maryland 20874 USA
Tel: [phone]
Fax:[phone]
Web: www.genecopoeia.com

All-in-One

TM

Q-PCR Primer Array 使用说明书

 产品概述.

Real-Time PCR 技术是在 PCR 反应体系中添加荧光物质或含荧光基团的探针,利用荧光信号的积累实

时监控整个 PCR 的过程, 以达到对未知样品的定性或定量分析的目的, 与常规 PCR 技术和芯片技术比较，

其快速、精确、定量、无污染及高通量等优点成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。

All-in-One

品中具有相似生物功能的基因簇或自选的特异 Pathway 基因进行表达差异谱分析的系统。其已把优化并通

过实验验证的 96 对各异的 All-in-OneTM Q-PCR Primer 按使用浓度交联到 96-Well-qPCR 反应板中, 其中已

包含有四对内参基因引物，研究人员仅需加入 All-in-One

并且所得结果可通过在线数据分析系统（采用 ΔΔCt 分析方法）立即进行分析，利用这种 Ready-to-Use 的

Primer Array 及其已优化的实验条件，研究人员可以快速、精确的筛选出感兴趣的基因进行下游研究。

TM

Q-PCR Primer Array 是采用 SYBR Green 染料法检测的 Real-Time PCR 技术，对不同样

TM

Q-PCR Mix、cDNA 及 ddH2O，即可上机反应，

 产品优势

1. 采用 Real-Time-PCR 技术进行样品间基因表达差异分析，具有快速、精确、定量、高通量等优点。

2．已对具有相似生物功能的基因簇或特异 Pathway 基因进行归纳整理到同一 Panel 中检测，可很直观

的筛选出具有特殊意义的基因进行下游功能研究。

TM

3. Ready-to-Use 的包装形式，仅需加入 All-in-One

便快捷。

4. 采用 ΔΔCt 分析方法的在线数据分析系统，快捷方便的进行结果处理

Q-PCR Mix、cDNA 及 ddH2O 即可进行反应，方

 使用注意事项

1. 本产品采用常温寄送、请将其保存于＋2℃～＋8℃。

2. 在使用本产品前请充分去除表面积累的水份，并短暂离心。

3. 使用本产品前注意产品所提示的与之匹配Real-Time PCR仪器。

4.为防止污染，实验时请严格遵守标准的PCR流程。

 产品提供形式

1． All-in-One

及相对应数量的 qPCR 热封膜。

TM

Q-PCR Primer Array 产品提供的最小规格为 2 张交联有引物的 96-Well-qPCR 反应板

1

TM

2． All-in-One

供四种与各仪器匹配的 96-well-qPCR 反应板的包装形式，如下所示：

包装形式 仪器公司 仪器型号

Q-PCR Primer Array 根据各研究人员实验室所使用 Real-Time PCR 仪器的不同，可提

ABI

Bio-Rad

A

Stratagene

PRISM SDS（7000、7300、7500、7700、7900）

iCycler iQ、MyiQ、iQ5、

Mx3000P、Mx3005P、MX4000

Eppendorf

B

C

D

ABI

Bio-Rad(原 MJ)

Roche

PRISM SDS（7500fast、7900fast）

Opticon（MJ)、Opticon2（MJ)、Chromo4（MJ）

LightCycler480、LightTyper System

 另需配套试剂、耗材及仪器

1. First Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia (Catalot＃ C0210A )

2. 2×All-in-OneTM Q-PCR Mix：GeneCopoeia (Catalog# D0101A)

3. 无DNase/RNase污染的枪头和离心管。

4．与All-in-One

TM

Q-PCR Primer Array相配套的Real-Time PCR仪器。

Realplex

■ 详细操作流程

1.Q-PCR 反应 Mix 量的准备

TM

公司同时提供有与 All-in-One

Real-Time PCR实验，研究人员可根据 96-well-qPCR Panel 的数量来确定 Q-PCR 反应数，一般 1 个 Panel

需要准备 100 次 qPCR 反应的 2×All-in-OneTM Q-PCR Mix，依次类推。

2．RNA 样品操作前的准备工作

为避免 RNase 对 RNA 样品的污染，所有实验要严格遵守 RNA 操作的要求。在实验前需准备高温

高压灭菌的微量离心管和移液枪头（如有条件，尽可能使用 DEPC 处理的耗材）；在实验操作中，需

戴口罩和一次性橡胶手套；所有反应液的配制等都需在冰上完成。

3．RNA 样品准备

高质量的 RNA 是基因表达精确检测的首要条件，对于抽提的 RNA 必须保证 RNA 无降解、无

DNA、RNase 及抑制剂污染。RNA 是否有降解可通过甲醛变性胶电泳检测，理论上当 28S:18S=2:1

时基本可以判定 RNA 无降解。同时 RNA 的质量还可以通过紫外分光光度法检测，质量好的 RNA

Q-PCR Primer Array 配套的 2×All-in-OneTM Q-PCR Mix 以供进行

2

其 OD

应在 1.7~2.0 范围内。

260/280

4、cDNA 的准备

高质量的 cDNA 也是基因表达精确检测的必要条件。建议使用 First Strand cDNA Synthesis

Kit(Catalot# C0210A) 进行 RNA 的反转录，其具体反转录流程可参考如下：

a. 融解 First Strand cDNA Synthesis Kit 内的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。

b. RNA-Primer Mix 的配制反应

往放置于冰上的 RNase free 的反应管内加入以下试剂

试剂组分 标准反应 2倍标准反应体系★

total RNA★ 1μg 2μg

250μM Random Primer

DEPC H

O 至总体积 13μl 至总体积 26μl

2

1μl

2μl

★ 请使用足量的 RNA 进行反转录，建议每个标准反应 RNA 的量控制在 500ng~2μg 之间，如

每标准反应 RNA 量小于 100ng 进行反转录可能会影响低表达基因的检测。

★ 因引物锚定的序列位置不一致，为提高反转录效率及扩增效率，建议使用随机引物反转录

★ 因一个 Panel 检测一个样品的表达，考虑到 cDNA 的使用量问题，建议采用 2 倍标准反应

体系进行 RNA 反转录，如同一个样品要进行 2 个或更多 Panel 的检测，请按 2 倍标准反应

体系重复进行 2 次或更多次的反转录

c. RNA 变性

混匀 RNA-Primer Mix，短暂离心，直接 65℃变性 10min 后立即放置冰上。这有助于减弱 RNA 二

级结构对反转录的影响，从而提高反转录效率。

d. 配制反转录反应液。

在 RNA-Primer Mix 反应管内加入以下试剂

试剂组分 标准反应 2倍标准反应体系★

RNA-Primer Mix

5×RT Reaction Buffer

25mM dNTP

25U/μl RNase Inhibitor

200U/μl M-MLV RTase (RNase H free)

ddH

O(DNase/RNase Free)

2

13μl

5μl

1μl

1μl

1μl

4μl

26μl

10μl

2μl

2μl

2μl

8μl

Final Volume 25μl 50μl

e. 反转录反应

反应条件设置为 37℃反应 1 小时。反应结束后，85℃灭活处理 5min

f．cDNA 样品处理及保存

混合相同样品反转录成的 cDNA 产物，用 ddH2O 稀释 5 倍，-20℃保存待用。

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