GeneCopoeia 2×AllinOne User Guide

使用说明书

2×AllinOneTM Q-PCR Mix ROX+(for ABI)

产品套装编号：D0102A

GeneCopoeia

Expressway to Discovery

GeneCopoeia Inc.
19520 Amaranth Drive
Germantown, Maryland 20874
USA
Tel: [phone]
Fax: [phone]
Web: www.genecopoeia.com

TM

产品内容

2×AllinOneTM Q-PCR Mix ROX
ddH2O（PCR Grade）

产品编号

+

D01020A
C10030A

包装规格

1 ml×2（20 µl反应×200次）
1 ml×2

储存条件：-20℃保存

产品概述

■

用试剂，产品中包含有DNA聚合酶、反应Buffer、dNTP、SYBR Green I和ROX。使用时只需加入
模板和引物即可在ABI仪器上进行Real-Time PCR 实验，操作非常方便快捷。

产品原理

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注意事项

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：

本产品是采用PCR技术结合SYBR Green I嵌合荧光法进行荧光定量PCR（Real-Time PCR）的专

本产品主要适用于市场上需要ROX校正的ABI 公司的 Real-Time PCR仪。

：

1．PCR技术

本产品中的DNA聚合酶是经特殊修饰的 DNA 聚合酶，此热启动酶结合优化的反应Buffer 能

有效地抑制非特异扩增产物的产生，极大地提高了PCR的扩增效率及其检测灵敏度。

2．SYBR Green I 嵌合荧光

SYBR Green I 是一种荧光染料，能特异地掺入到双链DNA分子的小沟部位，发出荧光信

号。在PCR 反应体系中，SYBR Green I 染料与DNA双链分子结合发出荧光，通过检测反应进
程中SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。同时在PCR结束后可以直接
进行融解曲线分析，从而判断是否存在着变异或非特异性扩增产物。

：

1．此产品应在-20℃避光保存，
2．使用前请缓慢颠倒混匀试剂，避免起泡，并经短暂离心后再使用。
3．配制PCR反应液时请使用PCR级水，同时避免强光照射。
4．为尽可能减少核酸扩增污染，请严格遵守标准的PCR流程。

避免在4℃或室温存放。

操作说明

■

：

1. 取出2×AllinOne

2. PCR反应液配制说明（例）（冰上操作）

TM

Q-PCR Mix ROX+，上下轻缓颠倒混匀，在配制前进行短暂离心。

试剂组分

2×AllinOneTM Q-PCR Mix ROX
PCR Forward Primer（4 µM）
PCR Reverse Primer（4 µM）
ddH2O（PCR Grade）

Template

Total Volume

体积

+

10 µl

2 µl
2 µl
1 µl
5 µl

20 µl

终浓度

1×

0.4 µM

0.4 µM

※

将2×AllinOneTM Q-PCR Mix ROX+设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适当比例调整。

如果要变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。

※

引物是Real-Time PCR的重要因素，在引物设计时，建议使用Oligo、Primer Premier等引物

设计软件。在PCR反应时，引物浓度通常在0.2 µM至0.6 µM范围内调整，一般浓度为0.4 µM
时能得到较好的结果。扩增效率不高时，可适当增加引物用量，但引物太多，可能会导致非特异
性扩增产物增加。

※

DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因拷贝数不同，必

要时可以进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如使用反转录cDNA作为模板，请稀释后
再使用。原液也可以用，但cDNA反转录体系对定量可能会产生影响。

3. 充分混匀PCR反应液，添加至PCR反应管或反应板中，并进行短暂离心

，确保所有试剂流到反应

管底部。

4. PCR反应，建议使用如下图所示的PCR反应程序及其融解曲线分析程序。

※

产品采用的DNA聚合酶为经过特殊修饰的热启动酶，需要95℃ 10 min充分激活酶活性。

※

PCR反应程序建议使用标准的三步法，同时荧光检测建议设定在PCR延伸过程中。

※

退火温度应该结合引物的Tm在55℃～60℃进行调整。引物结合的最佳值可能超出此范围，可以

根据实际情况进行调整。

※

Real-Time PCR扩增的片段最佳长度为80~150 bp，可以适当延长至300 bp。

※

融解曲线分析的起始温度值可以在60～80℃范围内适当调整。

数据分析

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：

根据实验设计进行必要的数据分析，具体操作参考所使用仪器的说明书。

实验示例

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：

1. 实验目的：通过梯度稀释质粒DNA，制作标准曲线，来判定2×AllinOne
的扩增效率及其检测灵敏度，其中检测片段长度为102 bp。

2. 使用仪器：ABI PRISM 7300

3. 操作流程：

1) 将质粒按10的倍数稀释成10

5

分子/µl ～ 1分子/µl共6个浓度梯度。

2) 配制PCR反应液（冰上操作）

试剂组分

2×AllinOneTM Q-PCR Mix ROX
PCR Forward Primer（4 µM）
PCR Reverse Primer（4 µM）

O（PCR Grade）

ddH

2

反应液mix

+

体积

10 µl

2 µl
2 µl
1 µl

15 µl

TM

Q-PCR Mix ROX

+