Agilent Metabolomforschung User Manual [de]

Das Agilent Metabolomics
Labor: Alle Werkzeuge für eine
erfolgreiche Metabolomforschung

ÜBERBLICK

Die Metabolomics-Forschung ist eine
logische Ergänzung groß angelegter
Studien auf den Gebieten Ex­pressionsprofiling und Proteomics
und liefert wertvolle Einblicke in die
Biochemie von Organismen. Sie stellt
Wissenschaftler aber gleichzeitig
auch vor analytische Herausfor­derungen. Agilent Technologies
unterstützt mit Fachwissen, Systemen
und Werkzeugen für die Datenanalyse,
damit diese Herausforderungen
bewältigt werden und eine erfolg­reiche Metabolomforschung
betrieben werden kann.

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Ein leistungsstarker Ansatz für die Erforschung biologischer Systeme

Metaboliten spielen in biologischen Systemen eine wichtige Rolle. Mit Metabolomics, d. h. der verglei­chenden Analyse von Metaboliten, die in ähnlichen biologischen Proben gefunden wurden, lassen sich
potenzielle Biomarker, Auswirkungen von Medikamenten oder Krankheiten auf bekannten oder unerwar­teten biologischen Pathways erkennen.

Metaboliten als wesentliche
Komponenten in biologischen
Systemen

Metaboliten spielen in biologischen
Systemen eine wichtige Rolle. Sie
transportieren Energie, ermöglichen die
zelluläre Kommunikation und Steuerung
und funktionieren als Bausteine für
andere Prozesse. Metabolitänderungen
liefern wertvolle Einblicke in die zugrunde­liegenden biochemischen Prozesse. Sie
dienen als Marker für Krankheiten und
weisen auf Zusammenhänge zwischen
Genen und Funktionen hin.

Die Metabolomics-Forschung dient dem
Verständnis biologischer Systeme. Sie
kann als leistungsstarke Ergänzung der
Genom- und Proteonomanalyse eingesetzt
werden.

Metabolomics – eine analytische
Herausforderung

Metaboliten weisen eine enorme
chemische Vielfalt mit beträchtlichen

Variationen in Bezug auf Struktur, funk­tionale Gruppen und physikochemische
Eigenschaften auf. Aus diesem Grund
und wegen der großen Häufigkeitsunter­schiede sind Metabolomanalysen sehr
schwierig. Darüber hinaus wird die
Aufgabe durch die unterschiedlichen
analytischen Anforderungen erschwert,
da das Ziel entweder darin besteht, Sub­stanzen zu finden, diese zu identifizieren,
zu quantifizieren oder alle diese drei Ziele
zusammen.

Es gibt kein Gerät und keine Technologie
mit Eignung für alle Metabolom­analysen. Die gemeinsam mit einem Gas­oder Flüssigchromatographiesystem ein­gesetzte Massenspektrometrie (GC/MS
bzw. LC/MS) ist die am häufigsten verwen­dete Analysenmethode. Die Kombination
aus Kapillarelektrophorese und Massen­spektrometrie (CE/MS) ist eine alternative
Lösung für hydrophile Substanzen. Metabo­lomuntersuchungen erfordern in der Regel
eine große Probenanzahl und komplexe

Datenverarbeitungsvorgänge. Daher
werden zudem leistungsstarke
Datenanalysenfunktionen benötigt.

Herausragende Werkzeuge für
die Metabolomforschung

Agilent Technologies liefert ein umfas­sendes Angebot an Werkzeugen für die
Metabolomforschung: Es beinhaltet GC-,
LC-, CE-, GC/MS-, LC/MS- und CE/MS­Systeme sowie leistungsstarke Software­applikationen zur Identifizierung von
Metaboliten, zur Quantifizierung und
statistischen Analyse.

Bei Agilent erhalten Sie Hardware,
Software, Verbrauchsmaterialien,
Service und Support verlässlich aus
einer Hand. Außerdem können Sie auf
ein sachkundiges Team aus Applikations­spezialisten zurückgreifen, die verstehen,
worum es bei Ihrer Arbeit geht, und die
Sie unterstützen, aus allen Experimenten
biologisch aussagekräftige Daten
abzuleiten.

Agilent bietet die umfassendste
Palette an Geräten und Software
für Metabolomics, einschließlich
vollständiger GC/MS- und
LC/MS-Systeme.

www.agilent.com/chem/metabolomics

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Das Agilent Metabolomics Labor

Der gesamte Prozess der Metabolom­analyse wird in verschiedene Schritte
aufgeteilt. Je nach untersuchten Proben
und Metaboliten weichen die Details
voneinander ab - der Prozess ist aber
immer gleich:

1. Profiling: Suche nach Metaboliten mit
statistisch signifikanten Abweichungen
in der Häufigkeit innerhalb einer kleinen
Probenmenge aus experimentellen und
Kontrollproben.

2. Identifizierung: Identifizierung der im
Profiling markierten Metaboliten.

3. Validierung: Validierung der stati­stischen Signifikanz der identifizierten
Metaboliten in den ursprünglichen Proben,
gefolgt von der Validierung gegen größere
Probenmengen, um die Auswirkungen
natürlicher Abweichungen auszuschließen.

4. Interpretation: Auswertung der
gefundenen metabolomischen Marker
im Kontext des entsprechenden
biologischen Systems.

Der Metabolomics-Workflow: Von der Probe über Daten zur biologischen Bedeutung

1. Profiling

Probenabhängige
Vorbereitung

Aufreinigung

Bibliothekssuche
nach Fragmenten
(GC/MS)

Datenbanksuche
(LC/MS)

Probenabhängige
Vorbereitung

Probenabhängige
Analyse

Standards
erfassen und
analysieren

Standards
und Proben
vergleichen

De-Novo-
Spektrenaus­wertung

Standards
erfassen und
analysieren

Standards
und Proben
vergleichen

Gezielte
Quantifizierung

Statistische
Analyse

Validierte
Metaboliten

Pathways
und Durchsatz/
Umsatz

NMR-Analyse

Probenabhängige
Analyse

Merkmaler­kennung

Datennorma­lisierung und
statistische
Analyse

Signifikante
Metaboliten

Metabolit­Identitäten

2. Identifizierung

3. Validierung

4. Interpretation

Der Workflow für die Metabolom­analyse ist ein mehrstufiger
Prozess mit unterschiedlichen
analytischen Herausforderungen
und Wahlmöglichkeiten bei jedem
Schritt.

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Profiling zur Suche nach stati­stisch signifikanten Metaboliten

Beim Profiling wird nach Metaboliten mit
statistisch signifikanten Abweichungen
in der Häufigkeit zwischen der experimen­tellen und der Kontrollgruppe gesucht.
Das Profiling kann sehr umfangreich
ausfallen, wenn Sie klare Ziele, aber nur
ein begrenztes Wissen über das unter­suchte System haben. Wenn Sie jedoch
mit einem gut untersuchten System
arbeiten, kann das Profiling sehr zielge­richtet durchgeführt werden. Häufig
ist die beste Vorgehensweise, beide An­sätze zu verfolgen, d. h. ein gezieltes
Profiling bekannter Metaboliten und eine
umfangreiche Merkmalerkennung zur
Suche nach unerwarteten Metaboliten.

Durch hierarchische Cluster­bildung werden Proben
basierend auf der Ähnlichkeit
ihrer Massenhäufigkeitsprofile
gruppiert. Diese Vorgehensweise
eignet sich zur Bewertung der
Datenqualität. Replizierte Proben
aus derselben experimentellen
Gruppe sollten enger beieinander
liegen als Proben aus unterschied­lichen Gruppen. In diesem Beispiel
erlaubt es die hierarchische
Clusterbildung bei Reisdaten
sofort zwischen der Wildreislinie
(TP309) und einer transgenen
Linie (TP309 Xa21

+

) zu unter-

scheiden.

Das Profiling setzt sich üblicherweise
aus folgenden Schritte zusammen:

• Methode auswählen: Auswertung der

Kenntnisse über das System und Ziele,
gefolgt von der Auswahl der besten
Methode für das Profiling

• Probenvorbereitung: Probenabhängige

Extraktion, Proteinpräzipitation und
Vorfraktionierung

• Analyse: Trennung und Nachweis von

Metaboliten, i. d. R. durch GC/MS oder
LC/MS

• Merkmalerkennung: Suche nach und

Quantifizierung aller Metaboliten in
der Probe

• Datennormalisierung: Korrektur der

durch Retentionszeiten oder Response
verursachten Drift

• Statistische Analyse: Erkennung

statistisch signifikanter Unterschiede
zwischen Probenmengen

Die analytische Reproduzierbarkeit ist
für das Expression Profiling von immenser
Bedeutung. Die Kombination aus normalen
Probenabweichungen und analytischen
Abweichungen bestimmt die Anzahl
an notwendigen Wiederholversuchen,
um festzustellen, ob die Unterschiede
zwischen Proben oder Probenmengen
statistisch signifikant sind. Je kleiner
die analytischen Abweichungen, desto
weniger Wiederholversuche sind
erforderlich.

www.agilent.com/chem/metabolomics

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Eine Suche in GC/MS­Spektrenbibliotheken kann
häufig zu einer schnellen
positiven Identifizierung
führen. In diesem Beispiel
wurde die Substanz positiv
als eine bestimmte Propion­säure identifiziert.

Eine Suche in der METLIN
Metabolite Database mit
TOF-Daten bekannter Masse
ergab für ein Metabolit mit
einer Masse von 130,0494
(Molekularion) sechs
mögliche Identitäten. Durch
das in der nachfolgenden
Q-TOF-Analyse erzeugte
MS/MS-Spektrum ließ sich
die Identität auf eines von
zwei Enantiomeren redu­zieren: Pyroglutaminsäure
oder Pyrrolidoncarbonsäure.

x10

3

0

1

2

3

4

5

Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z)

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

84,04484

56,05052

130,05320

(gemessen)

Häufigkeit

MS/MS-Spektrum von

Vorläuferion m/z 130,0532

NH

C

O

OH

H

+

O

N

H

+

O

-CH2O

2

N

H

+

CH

2

-CO

Das Agilent Metabolomics Labor

Identifizierung signifikanter
Metaboliten

Nach dem Profiling müssen die stati­stisch signifikanten Metaboliten identi­fiziert werden. Es gibt vier übliche Vor­gehensweisen:

• Suche in Spektrenbibliotheken:

Kann eine erneute Analyse überflüssig
machen und liefert eine positive
Identifizierung. Diese Methode wird
am häufigsten mit reproduzierbaren
EI-Spektren aus GC/MS-Analysen
verwendet.

• Datenbanksuche: Wird häufig mit

LC/MS-Daten verwendet, um nach
wahrscheinlichen Identitäten zu
suchen. Mit einer guten Datenbank
ist die Suche relativ einfach. Zur
positiven Identifizierung müssen
jedoch Standards erfasst und
analysiert werden.

• De-novo-Spektrenauswertung: Ist vor

allem bei der Erforschung gut unter­suchter Systeme möglich, erfordert
aber hervorragende Fachkenntnisse.
Für eine positive Identifizierung müssen
Standards erfasst und analysiert werden.

• Aufreinigung und NMR-Analyse:

Hoher Zuverlässigkeitsgrad, kann
aber schwierig, zeitaufwändig und
kostenintensiv sein.